Ras1、Rac1、Rho1基因在阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相中的表達差異

陳珊珊 周劍峰 廖勇 李海濤 王瑞麗 巴根 呂雪蓮 楊蓉婭

100700北京，解放軍陸軍總醫院皮膚科

Ras1、Rac1、Rho1基因在阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相中的表達差異

陳珊珊 周劍峰 廖勇 李海濤 王瑞麗 巴根 呂雪蓮 楊蓉婭

100700北京，解放軍陸軍總醫院皮膚科

目的研究Ras1、Rac1和Rho1基因在阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相中的表達差異，探討其在菌絲生長過程中的作用。方法分別培養阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相，提取兩組的總RNA，采用熒光定量PCR方法測定兩組中Ras1、Rac1和Rho1 mRNA的相對表達量。結果酵母相菌絲生成率（0.40%±0.53%）顯著低于菌絲相（99.33%±0.57%，t=13.93，P＜0.05）。實時熒光定量PCR顯示，以酵母相為對照組，將其Ras1、Rac1、Rho1基因表達量均設為1，則菌絲相的Ras1、Rac1、Rho1基因mRNA相對表達量分別為25.17±10.99、16.81±7.80、42.61±18.50，與酵母相比較，差異有統計學意義（t值分別為3.81、3.51、3.90，均P＜0.05）。結論Ras1、Rac1、Rho1基因可能參與了阿薩希毛孢子菌菌絲的生長過程。

毛孢子菌屬；單體GTP結合蛋白質類；阿薩希毛孢子菌；Ras1；Rac1；Rho1；酵母相；菌絲相

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）是一種條件致病真菌，在細胞形態上可表現為酵母樣芽生孢子、關節孢子、真菌絲和假菌絲。真菌的形態轉換在其生長、播散感染中發揮重要作用，其中酵母相與菌絲相間的相互轉換關系復雜，而這種轉換對其環境適應和毒力都有重要影響［1-3］。Ras超家族蛋白是最早發現的小G蛋白，主要包括Ras、Rab、Arf、Rho和Ran 5個亞家族，具有GTP酶活性，在形態轉換的調控通路中起重要作用。Rac1和Rho1作為Rho家族蛋白的重要成員，在真菌極性生長中發揮重要作用［4］。有研究顯示［5］，Rho家族蛋白成員Cdc42在T.asahii的菌絲相中的表達明顯高于酵母相，很可能參與T.asahii菌絲的生長。本研究采用熒光定量PCR檢測Ras1、Rac1、Rho1 mRNA在T.asahii酵母相和菌絲相中的表達水平，以了解Ras1、Rac1、Rho1基因與T.asahii菌絲形成的關系。

一、材料和方法

1.實驗菌株、試劑和儀器：T.asahii標準株CBS2479，購自荷蘭皇家藝術與科學學院真菌多樣性研究中心（CBSKNAW）。酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖）、玉米培養基（北京奧博星生物技術有限公司），RPMI1640培養基（美國Gibco公司），Trizol試劑（美國Sigma公司），cDNA第1鏈合成試劑盒（美國Invitrogen公司），熒光定量PCR檢測試劑盒（美國ABI公司），PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。HIQ-E雙層空氣恒溫振蕩器（北京東聯哈爾儀器制造有限公司），NanoDrop2000分光光度計（美國Thermo Scientific公司），LightCyler 480熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

2.T.asahii酵母相、菌絲相的培養及觀察：將YPD斜面生長48 h的T.asahii標準株CBS2479接種于YPD液體培養基，密度調整為5.0×106/ml，置搖床25℃振蕩培養24 h，1 500×g離心5 min，棄上清液，以無菌去離子水洗滌并調整細胞密度至5.0×108/ml。取200 μl高濃度菌液，加入4.8 ml無菌水稀釋，分別取1 ml稀釋液平鋪于5個直徑為90 mm玉米固體培養基上，35℃培養5 d，以獲得酵母相；取200 μl高濃度菌液接種于1個50 ml RPMI1640液體培養基，37℃振蕩培養24 h，以獲得菌絲相［5］。

從玉米培養基上刮取適量菌落，從液體培養基中取10 μl菌懸液，均于光鏡下（×200），在血細胞計數板上計數100個細胞中形成菌絲的細胞數，得出百分數。重復試驗3次。以菌絲長度為孢子直徑3倍以上者作為菌絲計數［6］。

3.T.asahiiRNA提取及反轉錄：收集菌懸液，離心，棄上清液，用去離子水重新懸浮，洗滌2遍，棄上清液，置于研缽中加入適量液氮研磨，在液氮未完全揮發前加入1 ml Trizol RNA提取試劑，按Trizol法提取總RNA，干燥后加入DEPC水20 μl溶解。用分光光度計測量提取的總RNA濃度和純度，并電泳測量RNA完整性。取純度和完整性較好的RNA進行反轉錄，每個樣品取總RNA 2 μg，采用反轉錄試劑盒按說明書進行反轉錄反應以合成第1鏈cDNA，反應條件：42℃20 min、95℃3 min，冰上冷卻后置于-20℃貯存備用。

4.T.asahiiRas1、Rac1、Rho1基因熒光定量PCR反應：采用熒光定量PCR檢測試劑盒按照說明書進行操作。配置PCR擴增體系（總體積20 μl）：1× Power SYBRgreen PCR Master Mix 10 μl、ddH2O 8 μl、待擴增基因的上下游引物各0.5 μl、模板cDNA 1 μl。擴增反應在Roche 480型熒光定量PCR儀中進行，反應條件：預變性95℃10 min；變性95℃15 s，退火/延伸60℃1 min，40個循環；60～ 95℃進行熔解曲線分析，每10 s升高1℃。基因的上、下游引物和退火溫度見表1，18S RNA為內參照。每個樣品均設置3個復管，重復試驗3次。分別測定酵母相和菌絲相中Ras1、Rac1、Rho1基因及內參基因18S RNA的Ct值，試驗結果取其均值，按照2-△△Ct相對定量公式計算菌絲相相對于酵母相的各基因mRNA轉錄水平，其中△△Ct=（菌絲相目的基因平均Ct值-菌絲相內參基因平均Ct值）-（酵母相目的基因平均Ct值-酵母相內參基因平均Ct值）。

5.統計學分析：應用SPSS13.0統計軟件，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1.T.asahii酵母相和菌絲相的形態觀察及菌絲生成率比較：T.asahii標準株于玉米培養基35℃培養5 d，鏡下觀察可見大量關節孢子及芽生孢子，基本為酵母相，菌絲生成率為0.40%±0.53%；而于RPMI1640培養基37℃培養24 h，鏡下觀察可見大量細長菌絲，可見分枝，菌絲間可相互纏繞，基本為菌絲相，菌絲生成率為99.33%±0.57%，兩者菌絲生成率差異有統計學意義（t=13.93，P＜0.05）。

2.Ras1、Rac1、Rho1基因在酵母相和菌絲相中的表達：實時熒光定量PCR顯示，目的基因和內參基因的熔解曲線峰均為單一峰形且峰形銳利，未見其他峰值。擴增曲線均光滑平穩，熒光吸收圖譜的S形曲線形狀完整，符合定量檢測要求。相對定量分析顯示，以酵母相為對照組，將其Ras1、Rac1、Rho1基因表達量均設為1，則菌絲相mRNA相對表達量分別為25.17±10.99、16.81±7.80、42.61±18.50，與酵母相比較，差異均有統計學意義（t值分別為3.81、3.51、3.90，P＜ 0.05）。

表1 各基因上下游引物及退火溫度

三、討論

真菌形態轉換的調控通路和相關基因復雜，而Ras超家族蛋白則是其中的重要成員，其中Ras1基因在真菌生長過程中發揮重要作用。例如在釀酒酵母中，Ras1同源蛋白通過cAMP/PKA、MAPK信號轉導通路及Rho蛋白系統，參與細胞周期、假菌絲生長和壓力應答力等多項細胞進程［7-8］，與其在白念珠菌中的作用類似。在白念珠菌中，Ras1蛋白通過cAMP/PKA通路來調控酵母形態、壓力應答、細胞黏附和交配［9］。白念珠菌不僅能形成酵母和假菌絲的形態，還能生成真菌絲，而這種酵母-菌絲的菌相轉換也是由Ras1蛋白通過cAMP/PKA和MAPK信號轉導通路調節［9］。在總狀毛霉的萌芽和菌絲生長階段，Ras1都有大量表達，且活性Ras1能增高萌芽期的生長率［10］。此外，Rac1和Rho1是Rho家族蛋白的重要成員，在真菌極性生長過程中也發揮重要作用。Hurtado等［11］研究發現，在解脂亞羅酵母中Rac1基因從酵母相轉化為菌絲相時表達量顯著提高。在玉蜀黍黑粉菌和麥角菌中，Rac1的缺失會破壞菌絲的極性生長［12-13］。在裂殖酵母、粗糙脈孢霉、白念珠菌、構巢曲霉等真菌細胞中，Rho1與細胞極性生長、細胞壁合成等活動直接有關［14-19］。Harris［20］發現，在黑曲霉中，Rho1突變株可影響細胞出芽生長。本研究中Ras1、Rac1、Rho1基因在T.asahii酵母相和菌絲相均有表達，但在菌絲相中的mRNA相對表達量均顯著高于酵母相，且差異有統計學意義，提示Ras1、Rac1、Rho1基因并非菌絲特異基因，但參與了細胞極性生長和酵母相轉換成菌絲相的生理過程。

綜上，Ras家族蛋白的代表成員Ras1、Rac1、Rho1與T.asahii生長有密切聯系，在不同真菌形態轉換中起到了很大作用。但這還需要進一步的實驗研究來驗證，如基因敲除、基因沉默等。這些基因在T.asahii菌絲生長過程中的具體調控機制及與致病性之間的關系也需深入的探討。

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中國麻風史料陳列館、中國醫學科學院皮膚病研究所史料陳列館征集文物和史料啟事

為真實記載中國麻風防治的發展歷程，全方位展現中國醫學科學院皮膚病醫院、研究所（簡稱院所）60余載的歷史變革和文化積淀，傳承和發揚老一輩無私奉獻的精神，院所決定籌建中國麻風史料陳列館、院所史料陳列館。即日起，面向社會各界廣泛征集具有歷史價值的文物和史料。

一、征集范圍

1.反映院所各歷史時期發展沿革、重大活動、科研成就、領導關懷及院所職工參加國內外重大活動等方面的重要文獻、題詞、圖片、新聞報道、手稿、徽標、紀念冊、音像制品、獎狀、證書等。

2.國家領導人、社會知名賢達及重要外賓、杰出校友來院所參觀、考察、訪問或演講時的題詞、圖片、新聞報道、音像制品等。

3.各類皮膚性病、麻風防治的圖片、圖表及文字說明，醫、教、研、防、管等領域工作中使用過的辦公用品、儀器設備、書籍教案、教學工具等實物。

4.反映中國麻風防治歷程及成就，麻風受累者的醫療及生活狀況等有歷史價值的文物和史料。

二、征集方式及要求

1.文物和史料的征集采用捐贈、代管、借用等方式。

2.所有文物和史料請提供文字說明，含來源、史料載體、形成時間及其所涉及的人物、事件等要素。

3.文物和史料的征集歡迎直接送達；亦可通過電子傳送、信函郵寄、預約拜訪、登門征集等途徑進行。

4.征集的文物和史料，均登記入冊；一經采用，除在史館陳列時標注捐贈者的姓名外，將授贈榮譽證書。

5.征集時間：長期征集。

三、聯系方式

聯系人：210042，南京玄武區蔣王廟街12號，中國醫學科學院皮膚病研究所中心辦公室（科研樓415室）諸萍，電話：025-85478032，傳真：025-85424903，Email：zhup@ncstdlc.org。

《中國皮膚性病學書目提要及著者傳略》征文及研修班招生

為了系統總結我國皮膚性病學文獻及介紹做出重要貢獻的著者，廖萬清院士、禤國維國醫大師領銜編輯《中國皮膚性病學書目提要及著者傳略》。凡為該書提供書目及著者傳略者、向籌建的中國皮膚科博物館贈送文物者，可獲贈《中國皮膚科學史》（600元）1冊。

為推廣我國政策規定的外用中藥臨方調劑、中醫中藥療法，2017年繼續舉辦全國皮膚美容化妝品制劑研修班，馬振友、李斌傳授實用處方，示教實習，學會為止。劉巧、劉紅霞等名中醫傳授示教火療、火針、臍療、薰蒸、煙薰、熨烙、鮮藥、刺絡拔罐、太乙神針等實用療法，學員互教互學。報名注冊者獲贈《皮膚美容化妝品制劑手冊》和《皮膚病中醫方劑制劑手冊》各1冊。贈送臨方調配乳膏基質及蒼龍嶺牌等皮膚外用產品試用。對索取征文及招生信息和獲取試用藥品者，來函必復、必贈。

陜西馬振友藥業有限公司，手機/微信：13227015533，13379033002；QQ：386966727。

Differences in expression of Ras1,Rac1 and Rho1 genes between yeast and hyphal phases of Trichosporon asahii

Chen Shanshan,Zhou Jianfeng,Liao Yong,Li Haitao,Wang Ruili,Ba Gen,Lyu Xuelian,Yang Rongya
Department of Dermatology,General Hospital of Beijing Military Command,Beijing 100700,China

s:Yang Rongya,Email:yangrya@sina.com;Lyu Xuelian,Email:mycoses@gmail.com

ObjectiveTo investigate differences in the expression of Ras1,Rac1 and Rho1 genes between yeast and hyphal phases ofTrichosporon asahii（T.asahii）,and to explore their roles in the formation of hyphae.MethodsThe yeast phase and hyphal phase ofT.asahiiwere cultured and served as yeast phase group and hyphal phase group respectively.Total RNA was extracted from the 2 groups,and real-time fluorescence-based quantitative PCR（RT-PCR）was performed to measure the mRNA expression of Ras1,Rac1 and Rho1.ResultsThe hyphal formation rate was significantly lower in the yeast phase group than in the hyphal phase group（0.40% ±0.53%vs.99.33% ±0.57%,t=13.93,P＜0.05）.When the mRNA expression of Ras1,Rac1 and Rho1 in the yeast phase group was all set as 1,that in the hyphal phase group was 25.17±10.99,16.81±7.80,42.61±18.50,respectively,with significant differences between the two groups in the three parameters（t=3.81,3.51,3.90,respectively,allP＜ 0.05）.ConclusionRas1,Rac1 and Rho1 genes may participate in the regulation of hyphal formation inT.asahii.

Trichosporon;Monomeric GTP-binding proteins;Trichosporon asahii;Ras1;Rac1;Rho1;Yeast phase;Hyphal phase

楊蓉婭，Email：yangrya@sina.com；呂雪蓮，Email：mycoses@gmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.013

國家自然科學基金（81471928、81571972）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81471928,81571972）

2016-05-11）

（本文編輯：周良佳 顏艷）