基因芯片技術在結核性膿胸治療中的應用

天津醫科大學（300070）韓東 孫大強

中國結核病年發病患者高達130萬，為世界第二大結核病發病國家，同時也是耐多藥結核病的高發病區[1]。結核性膿胸作為常見的肺外結核病，患病者眾多，病因多由結核性胸膜炎治療不徹底發展形成，就診時多已發展至包裹期，單純抗結核藥物或姑息引流治療效果較差，需要手術治療[2]。近年來，手術方式的進步使得患者治療效果顯著。但在臨床工作中，部分患者在術后規范抗結核治療的同時仍出現了復發甚至是反復多次復發的情況，林森林等[3]的研究發現在肺結核病復發患者中耐藥率較高，結核性膿胸復發病例中可能同樣存在較高的耐藥率，但傳統的細菌培養檢測方法結核菌檢出率低且耗時長，對于結核菌耐藥性的確定以及抗結核方案的調整作用甚微。近年來出現的基因芯片技術通過直接檢測結核菌DNA及耐利福平基因rpoB及耐異煙肼基因katG、inhA的突變位點，從而確定結核分枝桿菌及其耐藥情況，具有準確、靈敏、快速的特點，對于結核分支桿菌的診斷以及耐藥性的檢測已被廣泛認可[4]，本研究運用基因芯片技術對結核性膿胸患者的壞死物標本進行檢測、分析并指導臨床治療，取得了良好的臨床效果。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2015年3月～2016年4月我院收治的結核性膿胸患者60例，術前HRZE抗結核方案治療至少2周，術中徹底清理膿腔內病灶及增厚纖維板，術后病理證實均為結核性，并繼續2HRZE/4HR方案抗結核治療。其中男性37例，女性23例，年齡最小16歲，最大58歲，平均27歲，其中12例為復發病例（單次復發8例，多次復發4例），術中留取壞死物標本，使用基因芯片法進行檢測。

1.2 實驗儀器與方法 檢測儀器采用德國Hain GT B48，檢測試劑為GenoType? MTBDRplus，試驗以DNA.STRIP?技術為基礎，對來自純培養物或病人肺部等結核菌陽性標本的結核分枝桿菌復合群及其耐利福平和/或異煙肼耐藥基因進行分子生物學檢測。通過檢測最有意義的rpoB基因突變（編碼RNA聚合酶β-亞單位）確定對利福平的耐藥性；檢測katG基因（編碼過氧化氫酶）確定對異煙肼的高水平耐藥，而檢測inhA基因的啟動子區（編碼NADH烯酰酸性磷酸酶還原酶）確定對異煙肼的低水平耐藥。

2 結果

2.1 壞死物結核分枝桿菌菌種鑒定結果 60例標本中結核分枝桿菌陽性49例，陰性7例，結核分枝桿菌檢出陽性率為81.6%，而其中12例復發患者的檢測結果均為陽性，本組60例標本同時進行了抗酸染色涂片及基因芯片檢測，抗酸染色法陽性9例，陰性51例，結核分枝桿菌檢出陽性率15%，其中12例復發患者中陽性結果3例，陰性9例，對比結果見附表1和附表2。

2.2 結核分枝桿菌耐藥基因結果 對于結核分枝桿菌鑒定結果為陽性的病例，進一步進行耐藥性的分子藥敏檢測，對本組中陽性病例共49例，其中包括復發病例12例，進行耐藥基因檢測，結果顯示共發現耐藥菌株8例，耐藥率12.7%，而這8例耐藥菌株均來自復發病例中，其中5株為對INH及RPF均耐藥的多藥耐藥株，3株為對RFP耐藥株。

附表1 基因芯片法和抗酸染色法檢測結果比較

2.3 調整抗結核治療方案療效 對于耐藥基因檢測陽性的8例復發病例，隨機分為觀察組及對照組各4例，觀察組繼續之前2HRZE/4HR抗結核方案，治療組根據其耐藥情況，參照相關指南[5]調整抗結核方案，對于耐INH病例調整抗結核方案為2REZ/7RE，對于耐RFP病例調整抗結核方案為3HZSE/15EHZ，對于耐INH、RFP病例調整抗結核方案為3THOEZAK/18THOE，并進行了6個月～1年的隨訪，隨訪期間觀察組4例病例中，2例再次出現了復發，而治療組4例病例中，未再出現復發的情況。

3 討論

近年來結核病疫情仍呈現上升趨勢，耐藥結核病也是造成這一結果的主要原因之一，對于這種耐藥結核病高發形勢，我國及世界范圍都在進行著相關的臨床研究，也提出了多種針對不同耐藥結核菌的抗結核方案及指南甚至個體化治療方案，但治療的前提需要細菌學及藥敏結果的支持。由于結核分支桿菌培養對于培養環境的要求高，培養十分困難，總體陽性率低，而在各種標本中壞死物的培養陽性率相對更低，比較而言，痰液中的結核分枝桿菌數量要高于壞死物，培養陽性率高于壞死物[6]，故之前相關研究[7][8]多針對耐多藥肺結核患者，研究結果表明治愈率雖然存在一定差異，但總體取得了一定的治療效果，而針對于壞死物的結核分支桿菌培養報道較少，無法提供相應的細菌學依據，所以在結核性膿胸病例中無法及時確定結核分支桿菌的耐藥情況，進行抗結核方案的調整及療效的觀察。

基因芯片技術近年來應用廣泛，相關研究[9]通過對傳統培養方法與基因芯片法進行對比顯示其擁有較高的敏感性以及準確性，而且較傳統培養方法所需時間明顯縮短，結核分枝桿菌的鑒定需要6～7小時，耐藥基因的檢測需要7～8小時即可完成分析，因此在結核分枝桿菌的檢測中應用越來越廣泛，同時基因芯片方法可廣泛用于多種標本的檢測，包括痰液、膿汁、胸腹水、壞死物甚至尿液，劉申的研究顯示壞死物的結核分枝桿菌檢出陽性率位于各類標本前列，明顯高于痰液等標本，而本研究中基因芯片法檢測壞死物結核分枝桿菌陽性率高達86%，甚至高于其之前研究。這對結核性膿胸的耐藥性分析提供了良好的依據，具有十分重要的意義。

通過對本研究的結果進行分析總結可以發現，全部60例患者均病理證實為結核性，基因芯片法檢測結核分枝桿菌陽性率達到88.3%，準確性及靈敏性較高，對比抗酸染色法優勢明顯，12例復發患者均檢測為陽性，進一步行耐藥基因檢測，共發現耐藥菌株8例，并全部來源于復發病例中，其中3例為耐多藥菌株，進一步通過對照觀察，調整抗結核治療方案的治療組未再出現復發，而沿用之前抗結核方案的觀察組中兩例患者痊愈，而仍有兩例患者再次出現復發情況。

結核病復發與多種因素有關，對于結核性膿胸而言，包括感染耐藥結核分枝桿菌、服藥不規律甚至手術清理不徹底等，本研究結果顯示耐藥基因陽性病例全部來自復發患者中，復發患者中耐藥病例比例達到66.7%，說明耐藥與復發關系緊密，這也與整體結核病復發患者中高耐藥率情況相符。通過對照實驗發現對于此類耐藥患者，及時調整抗結核方案至關重要，治療組4例患者根據結核藥物耐藥情況，及時根據指南調整了抗結核治療方案，通過隨訪發現，4例患者恢復良好，均未在出現復發情況，而觀察組仍出現了部分復發情況，可見對于耐藥基因檢測結果在抗結核治療中起到了重要的指導意義。

4 總結

本次研究進一步證實了基因芯片在結核分枝桿菌檢測中的敏感性及準確性，而耐藥基因檢測的結果，也表明耐藥結核分支桿菌對結核性膿胸復發所起的作用，同時通過對復發病例調整抗結核方案取得的良好臨床效果，在臨床工作中的作用值得肯定。