不同病期慢性阻塞性肺疾病趨化因子受體3和淋巴細胞亞群的表達及其影響

張志亮，李斯南，陳 昊，羅 濤，陳玉玲

(徐州醫科大學附屬醫院呼吸內科，江蘇 徐州 221002)

不同病期慢性阻塞性肺疾病趨化因子受體3和淋巴細胞亞群的表達及其影響

張志亮，李斯南，陳 昊，羅 濤，陳玉玲

(徐州醫科大學附屬醫院呼吸內科，江蘇 徐州 221002)

目的 觀察急性加重期、穩定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血中的趨化因子受體3(CXCR3)及淋巴細胞亞群水平，并闡明其對COPD的影響。方法 選取徐州醫科大學附屬醫院呼吸內科2015年1月至2016年6月先后收治的急性加重期、穩定期COPD患者以及健康體檢人員各43例，將其分為急性加重期組、穩定期組及健康對照組；檢測血中T細胞亞群、B淋巴細胞及CXCR3的表達水平，并進行分析比較。結果 與健康對照組比較，各病期的COPD患者血中T細胞亞群的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+以及B淋巴細胞水平明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，同時，急性加重期組和穩定期組的血中T細胞亞群的趨化因子受體3(CXCR3)在CD4+、CD8+表面的表達均明顯增高，且急性加重期組也高于穩定期組，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論 急性加重期的COPD患者機體的細胞免疫系統和體液系統功能失衡，淋巴細胞亞群與其趨化因子受體3對急性加重期的COPD患者的病情發生和發展可能具有重要影響。

淋巴細胞亞群；趨化因子受體3；慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統中一種慢性進展性疾病，并以肺部不可逆的氣流受限和持續的炎癥性反應為特征[1]。近年來，人們一直對其發病機制進行了許多研究。目前關于淋巴細胞對COPD影響的研究相對較少。資料表明，淋巴細胞中的T細胞是COPD發病中重要的炎癥細胞，其表面存在的趨化因子(chemokine)發揮了重要作用，其中CXC型趨化因子受體3(CXCR3)是與趨化因子結合的重要受體之一，廣泛地存在于T淋巴細胞的表面，與淋巴細胞向炎癥部位遷移密切相關[2]，但也還有爭議。本研究旨在觀察不同病期的COPD，各淋巴細胞表面CXCR3及其亞群的表達水平，以闡明其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取徐州醫科大學附屬醫院呼吸內科呼吸內科2015年1月至2016年6月收治的43例急性加重期COPD患者、43例穩定期COPD患者以及43例健康體檢人員，將其分為急性加重期組、穩定期組及健康對照組。其中急性加重期組女性18例，男性25例，年齡45～89歲，平均(65.2±4.3)歲；穩定期組女性19例，男性24例，年齡49～85歲，平均(69.3±6.5)歲；健康對照組女性21例，男性22例，年齡52～87歲，平均(67.4±3.9)歲，三組受試者的性別和年齡比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 納入標準 COPD患者的診斷按照2013年中華醫學會呼吸病學分會《慢性阻塞性肺疾病診治指南》標準進行[3]。對COPD加重期的患者排除急性心肌梗死、哮喘急性發作、糖尿病、免疫系統及惡性腫瘤等疾病；COPD穩定期的患者是在加重期后有效地抗感染、止咳祛痰、氣道通暢、病情穩定一周后者；健康對照組為我院體檢中心同期、無吸煙史、無心肺等疾病的健康體檢者。

1.3 儀器與試劑 采用美國Beckman流式細胞儀及其隨同原裝試劑。

1.4 方法

1.4.1 檢測的指標 對急性加重期組、穩定期組患者以及健康對照組靜脈血中CXCR3、T淋巴細胞亞群(CD3+，CD4+，CD4+/CD8+)及 B淋巴細胞表達的百分比。

1.4.2 受試者的靜脈血單個核細胞(PBMNC)的提取和分離 COPD急性加重期患者于入院后次日的清晨空腹抽取4 mL靜脈血置于抗凝管，用等體積的PBS緩沖液混勻后最后加入淋巴細胞分離液，以密度梯度離心法分離出單個核淋巴細胞；COPD穩定期患者于治療后穩定一周時抽血檢查，健康對照組者體檢時抽血檢查。

1.4.3 流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群及B細胞的表達[4-5]將已制備的PBMNC懸液100 μL分別加入流式細胞儀專用試管甲、乙兩管內。然后在甲管中加入PE(藻紅蛋白)標記的抗CD4+抗體和FITC(異硫氰酸熒光素)標記的抗CD8+抗體、PerCP(多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物)標記的抗CD3+抗體、APC標記的抗CD19+抗體(B淋巴細胞特異性標記物)各5 μL；乙管中加入同型相應對照液。經混勻、室溫避光30 min，固定洗滌后上機檢測各細胞亞群比例。

1.4.4 流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群表面CXCR3的表達 取已制備的PBMNC懸液100 μL分別加入流式細胞儀專用試管甲、乙兩管內。然后在甲管中加入PE(藻紅蛋白)標記的抗CD4+抗體和FITC(異硫氰酸熒光素)標記的抗CD8+抗體、PE-Cy5標記的抗CXCR3抗體各5 μL；乙管中加入同型相應對照液。經混勻、室溫避光30 min，固定洗滌后上機檢測并分析計算CXCR3表達的百分比[6]。

1.5 統計學方法 應用SPSS18.0統計學軟件進行數據分析，計數資料采用百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差(s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受試者淋巴細胞各亞群表達水平比較 與健康對照組比較，穩定期組、急性加重期COPD組的血中 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、B細胞水平明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 三組受試者CD4+CXCR3、CD8+CXCR3表達水平比較 與健康對照組比較，穩定期組、急性加重期組的外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞表面的CXCR3表達水平均明顯增高，且急性加重期組高于穩定期組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表1 三組受試者淋巴細胞各亞群表達水平比較s，%)

表1 三組受試者淋巴細胞各亞群表達水平比較s，%)

注：與健康對照組比較，aP＜0.05。

?

表2 三組受試者CD4+CXCR3、CD8+CXCR3表達水平比較(，%)

表2 三組受試者CD4+CXCR3、CD8+CXCR3表達水平比較(，%)

注：與健康對照組比較，aP＜0.05；與穩定期組比較，bP＜0.05。

?

3 討論

COPD是一種常見的呼吸系統慢性炎癥性疾病，可進一步發展為肺心病和呼吸衰竭，具有較高的致殘率和病死率，已成為國內導致患者死亡的主要原因之一[7-8]，對COPD發病機制的研究始終是這一領域的熱點，但尚未完全闡明，COPD急性發作的最主要原因是由有害氣體或顆粒進入呼吸道誘發急性炎癥所致[9]。多數認為COPD主要與自由基、炎性細胞(如中性粒細胞、淋巴細胞)的參與有關，肺泡巨噬細胞、T淋巴細胞和中性粒細胞在COPD患者肺組織中浸潤，并且與氣流受限的程度呈正相關[10-11]。故筆者認為：深入研究COPD的發病機制是尋找其有效防治和改善預后的關鍵。

眾所周知，淋巴細胞是人體免疫系統中最重要的部分，它們參與人體細胞免疫和體液免疫，不僅具有識別和排斥抗原的作用，而且對人體的免疫應答具有重要的調節能力，它們能夠防御病毒和細菌的感染。此外，在呼吸道及全身炎癥損傷中，T淋巴細胞亞群的免疫功能出現了異常，故被認為，T淋巴細胞是免疫系統內最重要的細胞群之一；B淋巴細胞主要參與機體的體液免疫，其數量的減少可反映體液免疫功能的低下。COPD的老年患者，由于其免疫功能下降，甚至出現明顯的免疫功能異常[12]。

本研究顯示，在急性加重期及穩定期的COPD患者血中T淋巴細胞各亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及B淋巴細胞的百分率與健康對照組比較明顯降低，其差異具有統計學意義(P＜0.05)，尤其在急性加重期更為顯著，在穩定期患者也尚未完全達到健康對照組水平，表明COPD患者在不同的病期均存在著持續的免疫功能的失衡，故此類患者很容易出現呼吸道反復感染。CD4+能輔助IgG、IgA、IgM合成，CD4+細胞減少導致產生淋巴因子協助B細胞產生抗體和輔助其他淋巴細胞的功能減弱。CD8+能抑制B細胞產生抗體[13-14]。T淋巴細胞各亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+下降可導致單核吞噬細胞活性降低，同時還可引起B淋巴細胞分泌抗體減少而易致反復的呼吸道感染，使病程遷延。我們的研究，進一步證明了淋巴細胞的免疫反應性在COPD發病機制中確實占有重要地位。

近來的研究顯示，趨化因子受體3(CXCR3)在由炎癥細胞等釋放后，主要在活化的T淋巴細胞等表面表達，在局部炎癥、移植排異反應等發揮重要作用[15]，我們的實驗結果提示，急性加重期組和穩定期組的COPD患者血中 CD4+、CD8+T淋巴細胞表面的CXCR3表達百分率與對照組比較，均明顯增高(P＜0.05)，并且急性加重期組也高于穩定期組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。故而筆者推測：在急性加重期組和穩定期的COPD患者，炎癥細胞等釋放的CXCR3增多，在活化的T淋巴細胞等表面表達增加，可能與多種趨化因子迅速結合，導致大量的炎癥細胞聚集到炎癥部位，致使肺部炎癥反復發作。由此可見，CXCR3是COPD病情發生和發展的相當重要的炎癥介質，參與了肺部炎癥的形成和加重。本研究的重要意義在于為如何抑制CXCR3配體的生成、阻斷CXCR3與其配體的結合及其結合后的活化過程，以減輕肺部的炎癥反應，提供了新的思考，這也是我們要共同面對的待解課題。

[1]Curtis JL.At the Checkpoint:Lung CD8+T Cells,Respiratory Viruses,and Chronic Obstructive Pulmonary Disease[J].American journal of respiratory and critical care medicine,2016,193(6):600-602.

[2]Lee S,Matsuzaki H,Maeda M,Yamamoto S,et al．Accelerated cell cycle progression of human regulatory T cell-like cell line caused by continuous exposure to asbestos fibers[J].Int J Oncol,2017,77(10):2594-2606.

[3]中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組,慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)[S].中華內科雜志,2013,46(36):254-261.

[4] Hodge G,Jersmann H,Hai B.et al.Lymphocyte senescence in COPD is associated with decreased histone deacetylase 2 expression by pro-inflammatory lymphocytes[J].Respiratory research,2015,16:130-131.

[5]楊曉霞,高興林,李東風,等.老年慢性阻塞性肺疾病患者外周血T細胞表達趨化因子受體3的研究[J].國際呼吸雜志,2010,30(21):1281-1284.

[6]Costa C,Rufino R,Traves SL,et al.CXCR3 and CCR5 chemokines in induced sputum from patients with COPD[J].Chest,2008,133(1):26-33.

[7] Zhou M,Wang H,Zhu J,et al．Cause-specific mortality for 240 causes in China during 1990-2013：a systematic subnational analysis for the Global Burden of Disease Study 2013[J].Lancet,2016,387(10015):251-272.

[8]鄭曉燕,陳芳建,吳芬芝.COPD患者外周血淋巴細胞亞群及其表面受體CXCR3的表達及相關分析[J].中國衛生檢驗雜志,2015,17(15):2919-2921.

[9]Agusti A,Soriano JB.Chronic obstructive pulmonary disease as a systemic disease[J].COPD,2008,5(2):133-138.

[10]Obeidat M,Nie Y,Chen V,et al.Network-based analysis reveals novel gene signatures in peripheral blood of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Respir Res,2017,18(1):72.

[11]Lee B,Ko E,Lee J,Jo Y,et al.Soluble common gamma chain exacerbates COPD progress through the regulation of inflammatory T cell response in mice[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis,2017,12:817-827.

[12]王娜,張湘燕,張程,等.慢性阻塞性肺疾病患者免疫功能的變化[J].貴州醫藥,2011,35(7):593-595.

[13]Kubota M,Taniguchi M,Tobisawa S,et al.T-Cell/Histiocyte-Rich Large B-Cell Lymphoma Presented as T-Lymphoid Hyperplasia Involving the Central Nervous System[J].Cureus,2017,9(3):e1119.

[14]Iwata S,Tanaka Y.The importance of B cell-T cell interaction in autoimmune diseases[J].Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi,2015,38(5):398-402.

[15]Srivastava R,Khan AA,Chilukuri S,et a1.CXCL10/CXCR3-Dependent Mobilization of HSV-Specific CD8+TEM and CD8+TRM Cells within Infected Tissues Allows Efficient Protection Against Recurrent Herpes Infection and Disease[J].J Virol,2017,91(14):e00278-17.

Expression and effect of CXCR3 and lymphocyte subsets at different stages in patients with chronic obstructive

pulmonary diseases.ZHANG Zhi-liang,LI Si-nan,CHEN Hao,LUO Tao,CHEN Yu-ling.Department of Respiratory,the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,Jiangsu,CHINA

Objective To observe the changes in the expression chemokine receptor 3(CXCR3)and lymphocyte subsets in patients with acute exacerbation and stable chronic obstructive pulmonary disease(COPD)and to elucidate their effect on COPD.Methods During January 2015 to June 2016,43 cases of acute exacerbating of COPD patients,43 stable COPD patients,and 43 healthy people in our hospital were selected as the research objects.The expression levels of T lymphocyte subsets,B lymphocytes and CXCR3 in blood were measured and analyzed.Results Compared with the control group,The levels of CD3+,CD4+,CD4+/CD8+of the T lymphocyte subsets and B lymphocyte subsets were significantly decreased in different COPD patients(P＜0.05);while the expression levels of CXCR3 on the surfaces of CD4+and CD8+of the T lymphocyte subsets in peripheral blood of different COPD patients were increased significantly,and those of the acute exacerbating of COPD patients were significantly higher than the stable COPD patients(P＜0.05).Conclusion The functions of the cellular immunity system and the humoral immunity system were dysbalanced apparently in patients with COPD acute exacerbating period.Lymphocyte subsets and their CXCR3 may have a significant effect on the onset and development of COPD patients with acute exacerbations.

Lymphocyte subset;CXC chemokine receptor 3(CXCR3);Chronic obstructive pulmonary disease

R563

A

1003—6350（2017）19—3208—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.037

江蘇省徐州市科技局社會發展科技計劃資助項目(編號：KC14SH092)

張志亮。E-mail：zzl_xz@msn.cn

2017-01-07)