張家口壩上地區(qū)人群環(huán)氧合酶-2基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病的相關性

鄒建平，張建軍，馬曉雁，王志恒，李林臣，劉素芳

(1.張家口市第一醫(yī)院急診科，河北 張家口 075000；張家口市第一醫(yī)院檢驗科，河北 張家口 075000；2.張家口市萬全中醫(yī)院外科，河北 張家口 076250)

張家口壩上地區(qū)人群環(huán)氧合酶-2基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病的相關性

鄒建平1，張建軍1，馬曉雁1，王志恒1，李林臣2，劉素芳3

(1.張家口市第一醫(yī)院急診科，河北 張家口 075000；張家口市第一醫(yī)院檢驗科，河北 張家口 075000；2.張家口市萬全中醫(yī)院外科，河北 張家口 076250)

目的 分析張家口壩上地區(qū)人群環(huán)氧合酶-2(COX-2)基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病的關系。方法 選取2015年6月至2017年1月于張家口壩上地區(qū)居住10年以上的居民200例為研究對象，其中健康者100例作為對照組，胃癌患者100例作為胃癌組，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性技術(PCR-RFLP)對兩組進行基因分型，然后經非條件性Logistic回歸分析COX-2基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs3218625與胃癌發(fā)病風險的關系。結果 對照組和胃癌組的年齡＜65歲者比例分別為55.0%及58.0%，男性比例分別為70.0%及74.0%；連續(xù)或偶爾吸煙者比例為47.0%及54.0%，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；對照組和胃癌組COX-2 SNP rs3218625基因型為GG的比例分別為93.0%及89.0%；基因型為GA的比例分別為5.0%及10.0%；基因型為AA的比例分別為2.0%及1.0%，基因型為(AG+AA)的比例分別為7.0%及11.0%；經非條件性Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，COX-2基因SNP rs3218625與胃癌的發(fā)生密切相關，且基因型GA出現(xiàn)頻率越高，胃癌發(fā)生風險越高(OR=2.463，P=0.021)。結論 張家口壩上地區(qū)人群COX-2基因多態(tài)性可能會增加胃癌的發(fā)生風險，其中SNP rs3218625位點GA出現(xiàn)頻率是胃癌發(fā)生的危險因素之一。

環(huán)氧合酶-2；單核苷酸多態(tài)性；胃癌；聚合酶鏈式反應

胃癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全世界范圍內所有惡性腫瘤的第4位。早期預防是避免胃癌發(fā)生的關鍵，通過了解胃癌在分子水平上的發(fā)病機制，可判定易感人群，進而為制定胃癌個體化防治的可行性對策提供一定的理論支持[1-3]。在導致胃癌的代謝酶基因中，環(huán)氧合酶-2(COX-2)的作用最為突出，已經成為當前胃癌研究領域的熱點，人類基因組中存在大量單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其是不同個體間疾病易感性、敏感性、表型等的遺傳基礎[4-5]。目前基于SNP的相關研究，已成為多基因復雜性狀疾病遺傳學分析的最為常用及有效的方法。以往研究表明，COX-2基因的啟動子區(qū)某些SNP可使其表達上調，使其攜帶者易患食管癌、胃癌和其他相關的消化系統(tǒng)癌癥疾病或其他人類癌癥，并與腫瘤細胞的增生、分化、浸潤、轉移密切相關[6-7]。張家口壩上地區(qū)地處高原，其氣候與生活習慣與其他地區(qū)相比具有一定的特殊性及差異性，本地胃癌患病率居高不下。本研究旨在從分子水平上揭示張家口壩上地區(qū)人群中調控生成COX-2的SNP與胃癌發(fā)病的關系，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月至2017年1月于張家口壩上地區(qū)居住10年以上的居民200例為研究對象。其中100例經胃鏡檢查及病變部位活檢確診的胃癌患者作為胃癌組，排除繼發(fā)病例與復發(fā)病例；既往有消化性潰瘍性疾病者；伴有其他惡性腫瘤或嚴重性疾病者。另100例健康者作為對照組，對照組健康者要求無癌癥家族史和慢性胃病史等。

1.2 方法

1.2.1 外周血提取基因組DNA 分別采集胃癌組與對照組血樣2 mL，經抗凝處理，離心取細胞沉淀，加入人紅細胞裂解液300 mL，3 min后離心30 s沉淀白細胞，加入35μL蛋白酶K，于50℃作用3 h，然后采用氯仿抽提法提取DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性技術(PCR-RFLP)檢測COX-2基因SNP rs3218625G/A多態(tài)性 PCR擴增引物序列：primer1：5'-CTATGGGCAGAGAGAAGGAG-3'；primer2：5'-AGCTTGCATGACCAGAACCC-3'；PCR反應體系均為50 μL：MgCl23.0μL，dNTPs 4.0μL，上下游引物各4.0μL，DNA聚合酶10 U，模板50 ng，10×Buffer 5.0μL，雙蒸餾水補至50 μL。擴增條件：95℃，5 min；94℃，30 s，52.4℃，30 s，72℃，30 s，共 40 個循環(huán)，72℃，7 min。PCR產物以Taq限制性內切酶酶切，酶切體系：PCR產物10μL，酶10 U，10×Buffer Tango 3.0μL，雙蒸餾水補至30μL，水浴37℃過夜。30 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果，另選取10%樣本進行重復檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，計數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差(s)表示，組間比較采用t檢驗；COX-2基因SNP rs3218625與胃癌發(fā)病的關系采用Logistic回歸分析，并用優(yōu)勢比和95%可信區(qū)間表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的一般資料比較 兩組受檢者的年齡、性別、吸煙史及萎縮性胃炎家族史等方面比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的一般資料比較[例(%)]

2.2 COX-2 SNP rs3218625基因PCR產物酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果 采用限制性內切酶MSPⅠ對各個基因型COX-2 SNP rs3218625基因PCR產物進行驗證，酶切產物為200 bp與182 bp的為GG基因型。酶切產物為382 bp、182 bp、200 bp的為GA型，酶切產物只有200 bp的為AA型，見圖1。

2.3 兩組受檢者COX-2 SNP rs3218625基因型的分布及其與胃癌的關系 COX-2 SNP rs3218625有3種基因型分別為GG、GA、AA，其在對照組與胃癌組中的頻率分別為93.0%，5.0%，2.0%及89.0%，10.0%，1.0%，兩組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律。經Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，COX-2基因SNP rs3218625與胃癌的發(fā)生相關，其中GA基因型攜帶者胃癌發(fā)病風險明顯升高(P＜0.05)，見表2。

圖1 SNPrs3218625PCR產物酶切后電泳圖(胃癌組)

表2 兩組COX-2 SNP rs3218625基因型的分布及其與胃癌的關系

3 討論

河北地區(qū)胃癌患病率46.29/10萬，胃癌的發(fā)生與遺傳、飲食和環(huán)境有關，且其中具有胃癌家族史人群的患病率是正常健康人群的3倍。目前有關張家口地區(qū)人群胃癌發(fā)生相關危險因素方面的研究還未見報道。COX-2基因是腫瘤患者靶向治療的候選基因之一，其過度表達與腫瘤細胞的過度增殖、侵襲及轉移等生物學行為密切相關，COX-2基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[8-9]。另外，張子房等[10]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中COX-2基因的陽性表達率顯著高于癌旁組織；國外研究也證實，胃癌發(fā)病至轉移期間COX-2基因均呈高表達狀態(tài)，COX-2基因異常高表達與胃癌進展過程中腫瘤細胞的增殖、轉化、侵襲及轉移均密切相關[11]。國外研究報道，COX-2基因與胃癌發(fā)生、發(fā)展具有重要關聯(lián)，是相關研究的候選基因，且目前靶向COX-2治療惡性腫瘤[12]，如食管癌、結腸癌等消化道腫瘤的研究已深入開展，并已取得一定的成效，COX-2基因有望成為預防、治療惡性腫瘤的基因靶點，成為今后腫瘤防治的研究方向。

本研究在進一步從遺傳水平上研究胃癌患者COX-2高表達的原因。COX-2基因表達可刺激血管生成因子表達增多，促進淋巴管、微血管生成，為腫瘤細胞的生長提供必需營養(yǎng)物質，同時也為腫瘤細胞進入循環(huán)系統(tǒng)提供了重要通道；COX-2基因表達還可增強基質金屬蛋白酶活性，提高腫瘤細胞與外基質蛋白的黏附能力，利于浸潤、轉移及侵襲等惡性生物學行為的發(fā)生，進而促進胃癌等惡性腫瘤的進展；COX-2還可使腫瘤血管生成、胃黏膜厚度增加和疏松化、降低機體對腫瘤細胞的局部免疫[13]。COX-2基因的啟動子區(qū)某些SNP可使基因表達上調，增加腫瘤發(fā)生的風險。胃黏膜損傷、胃潰瘍、胃癌或癌前損傷患者病變組織中COX-2 mRNA及COX-2蛋白表達量顯著升高，對胃癌的發(fā)生中具有一定的作用[14]。COX-2基因包含10個外顯子及9個內含子，SNP rs3218625位于第10外顯子，其G＞A改變導致氨基酸Gly轉變?yōu)锳rg，使該位點酶活性明顯增加[15]。此外，已有研究報道，COX-2基因SNP rs3218625 G＞A這一多態(tài)性與中國人群食道癌的發(fā)生密切相關，其中AG基因型可明顯增加食道癌發(fā)病的風險[16]。因此本研究以COX-2基因的SNP rs3218625 G＞A為研究位點，并與本地域人群一般資料相結合，從分子遺傳水平分析胃癌患者COX-2高表達的原因。本研究結果顯示，COX-2 SNP rs3218625有3種基因型分別為GG、GA、AA，其在對照組及胃癌組中的頻率分別為93.0%、5.0%、2.0%及89.0%、10.0%、1.0%，兩組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律，經Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，COX-2基因SNP rs3218625與胃癌的發(fā)生相關，其中GA基因型攜帶者胃癌發(fā)病風險明顯升高，與相關研究[17]結果相似，可能是由于SNP rs3218625 G＞A的改變導致了Arg的產生，使得酶活性增高，由于COX-2基因編碼區(qū)SNP不同，導致不同個體對環(huán)境中致癌物的敏感性不同，AG基因型可增大酶活，增強機體對對環(huán)境中致癌物的敏感性，因而促進了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，張家口壩上地區(qū)人群COX-2基因SNP rs3218625與胃癌發(fā)生密切相關，其中SNP rs3218625基因型GA是胃癌發(fā)生的危險因素之一。

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Correlation of COX-2 genetic polymorphisms with incidence of gastric cancer in Bashang area of Zhangjiakou.

ZOU Jian-ping1,ZHANG Jian-jun1,MA Xiao-yan1,WANG Zhi-heng1,LI Lin-chen2,LIU Su-fang3.1.Emergency Department,the First Hospital of Zhangjiakou,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,the First Hospital of Zhangjiakou,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA;3.Wanquan Hospital of TCM,Wanquan 076250,Hebei,CHINA

Objective To explore the correlation of cyclooxygenase-2(COX-2)genetic polymorphisms with incidence of gastric cancer in Bashang area of Zhangjiakou.Methods A total of 200 residents who lived in Bashang area of Zhangjiakou for more than 10 years were selected from Jun.2015 to Jan.2017,including 100 healthy people(control group)and 100 patients with gastric carcinoma(gastric carcinoma group).Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism technique(PCR-RFLP)was applied to analyze the genetic typing of the two groups,and the correlation of single nucleotide polymorphism(SNP)rs3218625 of COX-2 with the risk of gastric cancer was analyzed by non-conditional logistic regression.Results The two groups showed no statistically significant difference in the proportion of subjects with age＜65 years(55.0%in the control group vs 58.0%in gastric carcinoma group),the proportion of males(70.0%vs 74.0%),and the proportion of subjects with continuous or occasional smoking history(47.0%vs 54.0%),P＞0.05.The proportion were 93.0%in the control group and 89.0%in gastric carcinoma group for GG of SNP rs3218625,5.0%and 10.0%for GA,2.0%and 1.0%for AA,and 7.0%and 11.0%for(AG+AA).Non-conditional logistic regression showed that COX-2 SNP rs3218625 was closely related with incidence of gastric cancer(OR=2.463,P=0.021).The higher the frequency of GA,the higher the risk of gastric cancer.Conclusion The COX-2 genetic polymorphisms can increase the risk of gastric cancer in Bashang area of Zhangjiakou,and the frequency of GA in SNP rs3218625 locus is a risk factor for gastric cancer.

Cyclooxygenase-2(COX-2);Single nucleotide polymorphism(SNP);Gastric cancer;Polymerase chain reaction(PCR)

R735.2

A

1003—6350（2017）19—3112—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.006

河北省2016年張家口市科學技術局與地震局項目(編號：1621049D)

鄒建平。E-mail：zoujianping17@163.com

2017-04-26)