干擾linc00152抑制膠質瘤細胞增殖與侵襲

羅冬冬，彭 彪，羅愛萍，胡 骕，趙海林，李 丹

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院神經外科1、肝膽外科2，廣東 廣州 510095)

干擾linc00152抑制膠質瘤細胞增殖與侵襲

羅冬冬1，彭 彪1，羅愛萍2，胡 骕1，趙海林1，李 丹1

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院神經外科1、肝膽外科2，廣東 廣州 510095)

目的 觀察干擾linc00152的人膠質瘤細胞株U251的增殖與侵襲情況。方法 培養膠質瘤U251細胞，將U251細胞分為觀察組和對照組，觀察組轉染linc00152-shRNA，對照組轉染control-shRNA，采用qRT-PCR法檢測兩組U251細胞中linc00152 mRNA的表達，采用MTT法觀察兩組細胞增殖能力，侵襲實驗檢測兩組細胞的侵襲能力。結果 qRT-PCR結果顯示，觀察組U251細胞中linc00152的mRNA表達量為(0.313±0.020)，明顯少于對照組的(1.017±0.082)，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；MTT結果顯示，觀察組的U251細胞的OD值為(0.444±0.032)，少于對照組的(0.679±0.052)，差異具有統計學意義(P＜0.05)；侵襲實驗結果顯示，觀察組穿過基質膠的U251細胞數量為(66.9±9.1)，明顯少于對照組的(146±12.2)，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)。結論在人膠質瘤細胞株U251中敲低linc00152能抑制細胞的增殖與侵襲。

膠質瘤；linc00152；增殖；侵襲

人腦膠質瘤是顱內最常見的原發性腫瘤，其中惡性膠質瘤約占60%。手術結合放、化療是腦膠質瘤治療的主要手段[1]。雖然目前隨著腫瘤治療研究的發展，腦膠質瘤的診斷和治療不斷進步，但其中位生存期仍沒有明顯提高，仍然只有手術后的9～12個月。因此，通過現代分子生物學手段闡明腦膠質瘤的發病機制，尋找腦膠質瘤診斷標志物以及潛在的基因治療靶點，以便對膠質瘤患者進行早期診斷、提高膠質瘤患者療效、改善膠質瘤患者預后的突破口。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，不但在正常生理過程中發揮重要作用，而且也參與人類疾病如癌癥的發生、發展、轉移，已經成為近期深入研究的熱點課題[2]。linc00152是lncRNA中的一個成員之一，有研究報道，linc00152在多種癌癥中表達上調并且與腫瘤的發展及患者的不良預后明顯相關[3]，然而其在膠質瘤的作用至今仍未見報道。本研究觀察了干擾linc00152的人膠質瘤細胞株U251的生長與侵襲情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，linc00152-shRNA與control-shRNA由Invitrogen公司設計構建，RNA抽提試劑盒購于Applied Biosystems公司，MTT粉購自美國Sigma公司，Transwell小室購于美國BD公司。

1.2 linc00152-shRNA轉染及細胞分組 培養膠質瘤U251細胞，將U251細胞分為觀察組與對照組，按2 mL細胞懸液/孔接種于6孔板中，放置培養箱培養至細胞密度達50%左右進行轉染。觀察組轉染linc00152-shRNA，對照組轉染control-shRNA。用滅菌無酶水稀釋linc00152-shRNA與control-shRNA質粒干粉，按說明配制成100 pmol/L溶液質粒備用。用不含血清的Opti-MEM培養液稀釋5 μ L的lipofecta-min2000，兩者分別混勻并室溫孵育5 min后加入6孔板中繼續培養48 h，收獲細胞。

1.3 MTT法檢測細胞增殖 消化上述兩組細胞，取200 μL即5 000個細胞接種于96孔板中，設置6個復孔，培養48 h后取出加20 μL MTT液/孔，再繼續培養4 h后取出加150 μL二甲基亞礬(DMSO)液/孔，低速振蕩10 min，選擇波長為570 nm，在酶標儀上測定各孔吸光值，實驗重復3次。

1.4 Transwell侵襲實驗 在Transwell小室中鋪加適量基質膠稀釋液，過夜并成膜。在上述兩組細胞中分別取100μL即含1×105個細胞/mL的細胞稀釋液接種至Transwell小室的上室，取500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液加至Transwell小室的下室，放置在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養36 h后取出來，用棉簽擦棄小室上腔殘存的細胞，滴加磷酸鹽緩沖液(PBS)輕洗兩遍，再放置在4%多聚甲醛中浸泡5 min，以固定小室背面細胞，結晶祡染色背面細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）液洗，倒置，晾干。光學顯微鏡下觀察并攝相，隨機選取4個高倍視野進行細胞計數，取平均值，實驗重復3次。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組U251細胞中linc00152的表達比較 qRT-PCR結果顯示，實驗組U251細胞中linc00152的mRNA表達量為(0.313±0.020)，與對照組的(1.017±0.082)比較，差異有顯著統計學意義(t=8.987，P＜0.01)。

2.2 兩組U251細胞增殖能力比較 MTT實驗結果顯示，實驗組的U251細胞的OD值為(0.444±0.032)，與對照組的(0.679±0.052)比較，差異具有統計學意義(t=3.215，P＜0.05)。

2.3 兩組U251細胞侵襲能力比較 Transwell侵襲實驗結果顯示，實驗組穿過基質膠的U251細胞數量為(66.9±9.1)，與對照組的(146±12.2)比較，差異均具有顯著統計學意義(t=8.318，P＜0.01)，見圖1。

圖1 linc00152-shRNA對膠質瘤U251細胞侵襲能力的影響（×100）

3 討論

近年來基因組研究證明幾乎所有的人類基因組都轉錄并產生大量的非編碼RNA[2]，廣泛參與人體生理、病理活動。lncRNA在腫瘤中的差異性表達與腫瘤的發生、發展密切相關，并且可能是腫瘤預后的一個獨立預測因子，因此具有極為重要的潛在臨床應用價值，有望成為腫瘤診斷的生物標志物及治療的分子靶點。目前研究發現與膠質瘤相關的多個lncRNA中有lncRNA ZEB1-AS1和SPRY4-IT1可作為膠質瘤的預后分子，并且能促進膠質瘤細胞的侵襲與轉移[3]；LincRNA MALAT1可通過抑制ERK/AKT信號通路抑制膠質瘤的生長與侵襲[4]；LincRNA NEAT1通過調控miR-499B-5P/C-Met軸調控膠質瘤的發生發展[5]。這些lncRNA與膠質瘤的發生發展、增殖、復發、診斷治療及預后均有著一定的相關性。隨著對IncRNA功能研究的不斷深入，IncRNA與腫瘤發生發展關系的研究雖取得了矚目的成果，然而大多數lncRNA的研究仍處于起始階段，其生物學功能及分子調控機制不明。前期研究通過qRT-PCR技術檢測發現linc00152在膠質瘤組織中表達明顯下調。為進一步明確linc00152在人膠質瘤中的作用，本次研究首先通過轉染技術將linc00152-shRNA轉于人膠質瘤細胞株U251中，以敲低該細胞中linc00152的表達水平。qRT-PCR實驗證實觀察組linc00152的mRNA水平較對照組均明顯下調，提示轉染成功。接下來進一步采用MTT法、侵襲實驗明確其對人膠質瘤細胞株U251增殖與侵襲的影響。MTT實驗結果顯示，在人膠質瘤細胞株U251中敲低linc00152后，細胞的增殖明顯下降。而侵襲實驗結果顯示，在人膠質瘤細胞株U251中敲低linc00152后，細胞的侵襲作用亦明顯減弱。

綜上所述，在人膠質瘤細胞株U251中敲低linc00152能抑制細胞的增殖與侵襲，其具體機制有待進一步研究。本項目以前期的重要發現為基礎，將進一步通過細胞實驗、動物體內實驗、臨床標本等方面深入研究linc00152在膠質瘤發生、復發、耐藥中的作用，為鑒定膠質瘤耐藥、復發及預后預測標志物以及開發提高膠質瘤化療敏感性的治療方法奠定基礎，具有潛在的臨床應用價值。

[1]Wang HX,Xu T,Jiang Y,et al.The challenges and the promise of molecular targeted therapy in malignant gliomas[J].Neoplasia,2015,17(3):239-255.

[2]Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CACancer J Clin,2011,61(4):212-236.

[3]Lv QL,Hu L,Chen SH,et al.A long noncoding RNA ZEB1-AS1 promotes tumorigenesis and predicts poor prognosis in glioma[J].International Journal of Molecular Sciences,2016,17(9):1431.

[4]Han Y,Wu Z,Wu T,et al.Tumor-suppressive function of long noncoding RNA MALAT1 in glioma cells by downregulation of MMP2 and inactivation of ERK/MAPK signaling[J].Cell Death&Disease,2016,7(3):e2123.

[5]Zhen L,Yunhui L,Hongyu D,et al.Long noncoding RNA NEAT1 promotes glioma pathogenesis by regulating miR-449b-5p/c-Met axis[J].Tumour Biology,2016,37(1):1-11.

Interference with linc00152 can inhibit glioma cell growth and invasion.LUO Dong-dong1,PENG Biao1,LUO

Ai-ping2,HU Su1,ZHAO Hai-lin1,LI Dan1.Department of Neurosurgery1,Department of Hepatobiliary Surgery2,Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA

Objective To observe the growth and invasion of human glioma cell line U251 interfered with linc00152.Methods Cultured glioma U251 cells were divided into the observed group and the control group.The observed group was transfected with linc00152-shRNA,and the control group was transfected with control-shRNA.The expression of linc00152 mRNA in U251 cells of the two groups was detected by quantitative reverse transcription-PCR(qRT-PCR)method.Tetrazolium-based colorimetric(MTT)assay was used to observe the proliferation ability of cells in the two groups.The invasive ability of the two groups cells was detected by invasion assay.Results QRT-PCR results showed that the expression of linc00152 mRNA of U251 cells in the observed group was(0.313±0.020),which was significantly lower than(1.017±0.082)in the control group(P＜0.01).MTT results showed that the OD value of U251 cells in the observed group was(0.444±0.032),which was significantly less than(0.679±0.052)in the control group(P＜0.05).Invasion assay results showed that the number of U251 cells passing through the matrix glue in the observed group was(66.9±9.1),which was significantly less than(146±12.2)in the control group(P＜0.01).Conclusion The knockdown of linc00152 in human glioma cell line U251 can inhibit cell proliferation and invasion.

Glioma;Iinc00152;Proliferation;Invasion

R730.264

A

1003—6350（2017）19—3097—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.001

廣東省廣州市醫學重點學科建設項目；廣州醫科大學科研基金（編號：2015C39）

羅冬冬。E-mail：865656249@qq.com

2017-03-26)