Ras協同mTOR/SREBP1—c上調miR—182—96—183在肝癌中表達

崔海鵬 劉凱 林映雪 張乘云 趙娟

【摘要】目的：探討Ras癌基因誘導的miR-182-96-183高表達機制。方法：采取H-ras12V轉基因小鼠肝癌及癌旁組織，miRNA高通量測序檢測miR-182-96-183基因表達水平。Wes ternblot檢測調控miR-182-96-183表達的相關信號通路活化狀態及其上游轉錄因子蛋白表達水平。結果：miRNA高通量測序結果表明：與PT相比，T中m1R-182-96-183mRNA表達顯著升高（P<0.01）。Wes ternblot檢測結果表明：與PT相比，T中ERK、mTOR活化水平顯著升高，SREBP-lc蛋白水平顯著升高。結論：Ras癌基因可能通過活化mTOR通路激活SREBP-1c上調miR-182-96-183的表達水平。

【關鍵詞】肝癌；miR-182-96-183：Ras：mTOR：SREBP-1c

Ras信號通路激活在肝癌中普遍存在[1]。miRNAs可通過抑制其靶基因的翻譯在癌癥的發展過程中扮演重要角色[2]，同時有研究表明miR-182-96-183家族在多種原發性腫瘤中發揮關鍵作用[3]。我們前期進行的miRNA高通量測序發現miR-182-96-183在肝癌組織中顯著表達，但其在Ras誘導的肝癌中高表達機制尚不清楚。本研究利用H-ras12V轉基因肝癌小鼠模型[4]初步探討了miR-182-96-183在肝癌中的表達調控機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

SPF級H-ras 12V轉基因小鼠，雄性，9月齡，體重30～40g，大連醫科大學SPF實驗動物中心。生產許可證SCXK（遼）2016-0003，使用許可證SYXK（遼）2016-0006。

1.1.2試劑

抗體p-ERK、p-mTOR、SREBP-1c購自Cell Signal公司。

1.1.3儀器

BG-blotMINI垂直轉印儀等。

1.2方法

1.2.1組織樣本的采集

分別采取轉基因小鼠肝癌和癌旁組織，迅速液氮冷凍保存。

1.2.2 miRNA高通量測序

組織樣本送至晶能生物公司進行Illumina miRNA測序。具體方法參見文獻。

1.2.3 Westemblot檢測

45μg蛋白10%SDS-PAGE分離并轉膜，封閉，一抗孵育過夜。二抗孵育1h，顯影，實驗重復三次。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計分析。計量資料以x土s表示，Shapiro-Wilk法檢驗數據符合正態分布，根據Levene方差齊性檢驗，兩組間差異比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1基因芯片檢測轉基因小鼠肝組織miR-182-96-183表達水平

高通量miRNA表達測序分析如表1，H-ras12V轉基因小鼠肝癌旁組織miR-96、miR-183表達值為0，在肝癌組織中表達量顯著增高（P<0.01），miR-182在肝癌組織中表達量顯著高于癌旁組織（P<0.01）。

2.2 ERK、mTOR、SREBP-1c表達水平檢測

如圖1所示，與癌旁組織相比，肝癌組織中p-ERK、p-mTOR、SREBP-1c蛋白表達顯著升高。

3討論

miRNA是一類長度約為22nt的非編碼單鏈小分子RNA，參與轉錄后基因表達調控[6]。有研究表明，腫瘤的發生伴隨miRNAs特異性表達[2]。為了探究Ras癌基因誘導肝癌發生過程中miRNAs的表達變化，采用高通量測序對H-ras12V轉基因小鼠肝組織miRNAs表達水平進行檢測。結果發現，與癌旁組織相比，肝癌組織中miR-182-96-183顯著升高（表1）。

miR-182-96-183是由同一染色體轉錄經初體、前體剪切修飾生成的3個成熟體miRNA[3]，可抑制下游靶基因的翻譯發揮關鍵作用。大量研究表明，miR-182-96-183的高表達在肝硬化、肝癌中發揮關鍵作用[6]，有研究發現，PI3K/AKT/mTOR可誘導轉錄因子SREBP可直接調控miR-182-96-183的轉錄[7]。實驗結果表明，在肝癌中mTOR活化水平顯著增高，轉錄因子SREBP-1c表達顯著增高（圖2）。由此推測：Ras誘導的肝癌發生中可能通過PI3K/AKT/mTOR誘導SREBP-1c促進miR-182-96-183的表達。

綜上所述，Ras癌基因可協同mTOR/SREBP-1c上調miR-182-96-183表達。但其確切分子機制有待被進一步證明。

（通訊作者：趙娟）

參考文獻

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