茶樹磷轉運蛋白基因CsPT4的克隆、亞細胞定位及表達分析

辛華洪，王偉東，王明樂，馬青平，甘玉迪，黎星輝

南京農業大學茶葉科學研究所，江蘇 南京 210095

茶樹磷轉運蛋白基因CsPT4的克隆、亞細胞定位及表達分析

辛華洪，王偉東，王明樂，馬青平，甘玉迪，黎星輝*

南京農業大學茶葉科學研究所，江蘇 南京 210095

茶園中磷肥的利用效率取決于茶樹體內與磷元素吸收、轉運及生理利用等相關蛋白的協同調控，而磷轉運蛋白（Phosphate transporter proteins，Phts）在此過程中起著關鍵的調控作用。本研究以茶樹品種龍井長葉（Camellia sinensis cv. Longjing-changye）為試驗材料，采用同源克隆的方法首次克隆獲得茶樹磷轉運蛋白編碼基因CsPht1:4（CsPT4）的全長cDNA。該基因全長1 642 bp，開放閱讀框（ORF）1 620 bp（GenBank登錄號：KY132100），編碼539個氨基酸。生物信息學分析顯示，CsPT4基因編碼蛋白分子量為59.12 kD，理論等電點（pI）為8.51；具有典型的 Pht1家族特性：“6-親水-6”跨膜結構。亞細胞定位結果顯示，該蛋白分布于質膜上，與Softberry軟件預測結果一致。熒光定量PCR表明：CsPT4在正常生長的茶樹根、莖、嫩葉、老葉中均有表達，在老葉中的表達量較高，在根部表達量最低。低磷處理，根和葉中 CsPT4上調表達水平均先上升后下降；根部CsPT4表達量48 h內各個時間點均高于葉部。缺磷處理，根和葉中CsPT4上調表達水平均升高；根部和葉部分別在72 h和48 h達最大值。本研究為茶樹響應低磷的分子機制提供了參考。

茶樹；磷轉運蛋白；基因克隆；亞細胞定位；表達分析

磷是植物生長發育所必需的元素之一，是ATP、磷脂和核酸等許多代謝物和大分子的重要組分，同時又參與植物體內多種生物化學途徑，如基因表達、信號轉導等[1-2]。然而磷在土壤中極易被吸附和固定，使得土壤中有效磷的濃度很低而難以滿足植物的吸收利用，因而土壤中有效磷缺乏成為限制作物產量的重要因素[3-4]。研究表明，植物對磷吸收、轉運是一個逆濃度梯度的主動運輸過程，這一過程主要依靠磷轉運蛋白來實現[3,5]。植物磷轉運蛋白根據其功能特征分為Pht1、Pht2、Pht3、Pho1和Pho2五大家族，其中Pht1家族主要成員在植物根系細胞膜中負責磷酸根的吸收、轉運，其表達受磷調控[6-8]，因此Pht1家族成為研究的熱點，也是研究得最為深入的植物磷轉運蛋白家族。近年利用 Pht1家族的保守性，分別從煙草[9-10]、擬南芥[11-12]、水稻[13-14]、大麥[3]、玉米[4]、油菜[15]、大豆[16]、菊花[17]、油茶[18-19]等植物中克隆到多個屬于 Pht1家族的磷轉運蛋白基因。

茶樹[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]主要種植于濕潤、半濕潤的熱帶、亞熱帶和溫帶的酸性土壤中，茶園缺磷的現象普遍存在，為了提高茶葉產量和質量，每年不得不施入大量的磷肥[20-21]。缺磷導致茶葉水浸出物、茶多酚、類黃酮、總游離氨基酸、茶氨酸等內含成分含量下降，從而降低了茶葉品質[22]。目前茶樹磷的研究比較廣泛，但關于茶樹應答低磷脅迫的研究比較少。迄今關于茶樹磷吸收、轉運的研究尚未見報道。研究茶樹Pht1基因對探索茶樹磷脅迫分子響應機制及提高磷利用效率具有重要意義。本研究以龍井長葉兩年生水培苗為試材，通過對茶樹磷酸轉運蛋白 Pht1家族基因 CsPht1:4（以下簡稱CsPT4）的分離克隆、亞細胞定位和該基因在根系中表達情況進行分析，為探索茶樹磷脅迫分子響應機制、磷高效種質資源篩選，以及分子育種提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌種與試劑

2015年9 月至2016年3月，以茶樹品種龍井長葉（Camellia sinensis cv. Longjing changye）為試驗材料。于2015年9月15日取正常生長的茶樹的根、莖、老葉、嫩葉、芽。低磷、缺磷處理前選取長勢一致的茶苗于光照培養箱中（晝夜溫度25℃/22℃，光周期12 h晝/12 h夜，光照強度 240 μmol·m-2·s-1，相對濕度 75%～80%）進行預培養至長出新根，完全營養液的配方組分參考 Wan等[23]，包括大量元素 NH4+-N 0.75 mmol·L-1、NO3-N 0.25 mmol·L-1、K 0.35 mmol·L-1、P 0.05 mmol·L-1、Ca 0.395 mmol·L-1、Mg 0.21 mmol·L-1、Al 0.25 mmol·L-1和微量元素Mo 0.17 μmol·L-1、B 3.33 μmol·L-1、Fe 2.10 μmol·L-1、Mn 0.5 μmol·L-1、Cu 0.13 μmol·L-1、Zn 0.51 μmol·L-1。根據前期預實驗和模擬土壤有效磷濃度 1～2 μmol·L-1[24-25]在2016年1月10日對水培茶苗進行正常磷（50 μmol·L-1）、低磷（1 μmol·L-1）、缺磷處理，并分別于0、6、12、24、48、72 h取新長出的根、老根和當年生第一成熟葉片。所采樣品立即投入液氮，－80℃保存備用。取處理3個月后的根（新根、老根）、莖、葉用于測定總磷濃度。

亞細胞定位載體pJIT166-GFP和大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α由本實驗室保存；rTaq聚合酶、pMD?-T5 Zero Cloning Vector、pMD?19-T Vector、dNTPs、DL2000 M arker、HindⅢ酶、XbaⅠ酶、熒光定量染料SYBR?GreenⅠ、T4 DNA連接酶、TdT、dCTP、RNA酶抑制劑、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）等均購自TaKaRa公司；pMD?-T5 Zero Cloning Vector、Blunt simple Vector、Trans-T1感受態細胞購于南京百斯凱科技有限公司；多糖多酚RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物，E. Z. N. A.TM Gel Extraction Kit D2500-02、Plasm id M ini Kit II購自OMEGA。所有引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其編號及序列見表1。

表1 基因克隆和定量PCR引物Table 1 Primers used for cloning and RT-PCR of CsPT4

1.2 磷濃度測定

樣品于75℃烘干至恒重，磷含量測定參照電感耦合等離子體原子發射光譜（ICP-AES）[26]。試驗數據采用SPSS 17.0進行統計處理，利用Duncan’s新復極差法做顯著性分析（P＜0.05）。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

取保存實驗材料，用多糖多酚RNA提取試劑盒提取總RNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA的完整性后，用 Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent, USA）檢測總RNA的質量，用NanoD rop ND-1000 spectrophotometer（NanoDrop, Wilm ington, DE）檢測總RNA的濃度。根據Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒反轉錄成cDNA。

1.4 茶樹CsPT4基因克隆

根據已在NCBI公布的油茶（GenBank: AHL44892.1）；大豆（GenBank: AEA 76640.1）、菊花（GenBank:AGK29560.1）、胡蘿卜（ GenBank:XP_017224754.1）、 擬 南 芥（GenBank：NM_001203533.1）、毛果楊（GenBank:XM_002312553.2）、 玉 米（GenBank: NM_001111799.1）磷轉運蛋白氨基酸序列中的保守區，利用Primer Prem ier 5.0軟件設計簡并引物PT4-Degenerate primer-F和PT4-Degenerate primer-R。以cDNA為模板擴增出的產物連接到 pMD?-T5 Zero Cloning Vector上并轉化入大腸桿菌DH5α中，進行菌落 PCR篩選，挑選陽性克隆進行測序，普通PCR擴增程序參照趙真等[27]。在獲得的片段序列上設計3'RACE和5'RACE的巢式擴增引物，參照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，美國）改進步驟進行 5'RACE和3'RACE。根據RACE得到的序列信息，拼接后設計引物擴增全長cDNA序列，cDNA全長采用高保真酶 PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase進行PCR擴增。回收全長 cDNA擴增片段，與Blunt simple Vector連接，轉化大腸桿菌Trans-T1感受態細胞，LB/Amp平板培養，挑選單菌落震蕩培養14 h，取1 μL菌液為模板，用載體通用引物M13F和M13R進行PCR鑒定，將鑒定的陽性克隆樣品測序。

1.5 CsPT4基因生物信息學分析

利用NCBI BLAST對測序結果進行檢索比對，DNAMAN6.0軟件分析酸堿氨基酸統計分析。運用ProtParam tool（http：//web.expasy. org/protparam）計算蛋白質的相對分子質量和理論等電點；ProtScale Sever（http://web.expasy. org/protscale）采用 Hphob/Doolittle的方法對CsPT4蛋白的親水/疏水性進行分析；使用MHMM（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）預測跨膜結構域；采用 NetPhos Sever 3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）程序對蛋白序列中的主要氨基酸殘基可能的磷酸化位點進行預測。利用在線軟件 Softberry（http://www.softberry.com/berry.phtml）[28]進行亞細胞定位預測。

1.6 CsPT4基因的亞細胞定位

以測序 CsPT4全長正確的菌液，提取質粒作為模板，以vector primer-HindⅢ、vector primer-XbaⅠ為F、R引物進行RT-PCR，將正確的亮帶進行膠回收，與平末端載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector連接，轉化到大腸桿菌，挑單克隆進行驗證。驗證正確的菌液提取質粒與pJIT166-GFP分別經XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，回收目的片段并用T4DNA連接酶連接，構建pJIT166-GFP/CsPT4融合表達載體，轉入DH5α，經PCR、酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進行測序驗證。金粉子彈的制備和轟擊洋蔥表皮細胞參照王明樂等[29]和Wang等[30]的方法。

1.7 實時熒光定量PCR

使用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉錄后按照 SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RnaseH Plus）使用說明進行熒光定量 PCR。為了研究基因 CsPT4在茶樹正常生長情況下芽、葉（老葉和嫩葉）、根、莖中的表達情況，提取了芽、嫩葉、老葉、莖、根的總 RNA，將提取的 RNA反轉錄成cDNA，以茶樹 β-actin基因（Accession No. HQ420251）[31]作為內參基因，使用 IQ5 multicolor real time PCR detection system（Bio-Rad, USA）進行實時熒光定量PCR反應，采用 2–ΔΔCT算法[32]分析結果。為了研究基因 CsPT4在低磷和缺磷處理下根部和葉部的表達情況，將在完全營養液下水培好的新根苗進行低磷處理（1 μmol·L-1）、缺磷處理。CsPT4基因在茶樹中的表達受低磷、缺磷誘導，為了研究該基因在不同誘導時間的表達情況，分別提取了經過低磷、缺磷處理 0、6、12、24、48、72 h等不同時間的根部和葉部的 RNA，經過反轉錄和熒光定量PCR檢測分析。

試驗數據采用SPSS 17.0進行統計處理，利用 Duncan's新復極差法做顯著性分析(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同磷水平對茶樹磷濃度的影響

茶樹在水培液正常生長3個月后，進行低磷（1 μmol·L-1）、缺磷處理3個月，結果表明，低磷、缺磷處理顯著降低了茶樹根、莖、葉中的磷濃度，新根的總磷含量高于老根（圖1）。

圖1 低缺磷處理對茶樹磷濃度的影響（平均值±標準差，P＜0.05）Fig. 1 Effects of different P treatments on P concentrations in tea plants (Mean±SD, P＜0.05)

2.2 CsPT4基因克隆與序列分析

在 NCBI中下載并比較不同植物同一家族的磷轉運蛋白基因序列，根據保守區域設計簡并引物，獲得592 bp的片段（圖2-A）。利用 5′RACE和 3′RACE得到的序列進行拼接后設計全長引物進行cDNA編碼區全長的特異擴增，克隆后測序結果表明，該條帶長度1 642 bp（圖2-D）。該基因編碼539個氨基酸，長度與其他物種同家族的磷轉運蛋白基因相近。

圖2 基因克隆電泳圖Fig. 2 Electrophoresis results of CsPT4 cloning

2.3 CsPT4生物信息學分析

2.3.1 CsPT4的進化分析

ORF分析表明，CsPT4基因含有1 617 bp的開放閱讀框，編碼 539個氨基酸（圖 3），其中酸性氨基酸65個，堿性氨基酸50個，中性氨基酸424個。同源比對發現，其氨基酸序列 與 油 茶 （ AHL44892.1）、 芝 麻（XP_011073523.1）、菊花（AGK29560.1）、胡 蘿 卜 （ XP_017224754.1）、 可 可（XP_007035103.2）的同源性大多在 70%以上；其中與油茶和芝麻的一致性達到 92%和83%。利用 ProtParam tool分析發現，CsPT4蛋白理論等電點（pI）為：8.51，分子式為C2737H4166N672O731S29，分子量為59.12 kDa。

圖3 CsPT4與其他植物的Pht1磷轉運蛋白氨基酸多序列比對Fig. 3 Alignment of amino acid sequence of CsPT4 with some selected Pht1 proteins in plants

2.3.2 CsPT4蛋白跨膜結構分析以及磷酸化修飾預測

ProtScale Sever在線分析整個蛋白質基本上表現出疏水性。HMMTOP對CsPT4進行的跨膜結構預測結果（圖4-A）顯示：CsPT4具有12個跨膜域，預測結果與報道的其他物種Pht1跨膜區結構一致[2]。磷酸化修飾預測發現整個蛋白質多肽鏈中分值大于 0.5的氨基酸位點共有19個，且非均勻分布在整個多肽鏈中，其中10個絲氨酸殘基（Ser）可能發生磷酸化，分別位于肽鏈的第99、122、153、163、193、206、282、439、510、515個位點；4個蘇氨酸殘基（Thr）可能發生磷酸化，分別位于肽鏈的第58、229、239、398個位點；5個絡氨酸殘基（Tyr）可能發生磷酸化，分別位于肽鏈的第37、155、194、199、231個位點（圖4-B）。

圖4 CsPT4的跨膜結構預測（A）和磷酸化預測（B）Fig. 4 The prediction of CsPT4 transmembrane domains (A) and phosphorylation (B)

2.4 CsPT4蛋白的亞細胞定位

基因槍轟擊洋蔥表皮后25℃暗培養18 h，利用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM780）對綠色熒光蛋白信號進行觀察，結果發現，轉pJIT166-GFP空載體的洋蔥表皮細胞內布滿了綠色熒光（圖 5-A），而轉pJIT166-GFP/CsPT4載體的洋蔥細胞內只有細胞質膜上有綠色熒光信號（圖 5-B），說明CsPT4蛋白定位于質膜。

圖5 GFP蛋白（A）和CsPT4蛋白（B）在洋蔥表皮中的定位Fig. 5 Subcellular localization of GFP protein (A) and CsPT4 protein (B) in onion epidermal cells

2.5 CsPT4基因的組織特異性表達分析

熒光定量PCR發現CsPT4在茶樹的芽、嫩葉、老葉、莖、根中均有表達；表達量由高到低依次為：老葉、嫩葉、芽、莖、根，在老葉中表達量最高，在根中表達量最低；隨著葉齡增加，表達量呈上升趨勢（圖6）。

圖6 CsPT4基因在茶樹不同組織的表達情況（平均值±標準差，P＜0.05）Fig. 6 Relative transcription level of CsPT4 gene in different tissues (Mean±SD, P＜0.05)

2.6 CsPT4基因在不同磷水平條件下的差異表達分析

低磷（1 μmol·L-1）處理茶樹后（設未處理的表達量為 1，下同），與對照相比，根部和葉部 CsPT4表達水平均先上升后下降，根部在12 h達到最大值（圖7-A）；葉部6 h即達到最大值（圖7-B）；根部CsPT4表達量48 h內各個時間點均高于葉部。缺磷處理，與對照相比，根和葉 CsPT4表達水平基本呈上升趨勢。根部在72 h達最大值（圖7-C），葉部至48 h達最大值（圖7-D）。

3 討論

植物磷轉運蛋白中 Pht1家族主要成員在植物根系細胞膜中負責磷酸根的吸收、轉運，其表達受磷調控[33-34]，因此 Pht1成為研究的熱點也是研究得最為深入的植物磷轉運蛋白家族。本研究利用該家族的保守性并結合cDNA末端快速擴增技術（RACE），首次從茶樹中克隆到磷轉運蛋白基因 CsPT4。發現 CsPT4編碼的氨基酸序列與油茶、芝麻等高親和磷轉運蛋白相似性高達80%以上，并含有Pht1家族蛋白的主要特點：位于質膜上，蛋白大小約59 kDa，含539個氨基酸殘基；預測保守結構為“6-親水-6”結構，即包括6個N端的跨膜區和6個 C端的跨膜區，中部由 1個親水環分隔開；家族保守序列GGDYPLSATIMSE位于第 4個跨膜域。同時，在系統進化樹中，CsPT4所在的亞家族Ⅰ磷轉運蛋白大部分已通過酵母突變體互補實驗，證明為高親和力磷轉運蛋白，如 AtPht1:4[11]、CmPT1[16]等。因此，可以推測 CsPT4為茶樹的高親和磷轉運蛋白基因。

Pht1家族基因表達受磷濃度調控[33]。現有報道在模式植物中 Pht1家族基因主要在根部接收低磷信號上調表達[34]，而通過熒光定量實驗發現 CsPT4在茶樹正常生長的芽、嫩葉、老葉、莖、根中均有表達，在老葉中表達量最高，在根中表達量最低；這與擬南芥[11]、水稻[13]等物種的主要表達于根部不同。可能因為磷是可移動的營養元素，又因為茶樹是多年生木本植物，推測正常生長情況下茶樹老葉中的磷轉移到幼嫩葉部而出現低磷狀態，從而高表達了CsPT4基因。在低磷和缺磷處理下，不管是茶樹根部還是葉部 CsPT4都上調表達了，說明了 CsPT4是受低磷脅迫響應的正調控誘導型基因，具有Pht1家族基因表達特點，這與轉 AtPht1:4基因擬南芥的結果一致[11]。在低磷處理下，根部上調表達高于葉部，說明CsPT4主要在根部表達，這與其他物種的Pht1基因表達一致[34]；上調表達出現先上升后下降可能是由于CsPT4轉錄的mRNA的累積效應。本研究雖然從茶樹中克隆到CsPT4基因，但是茶樹 Pht1基因家族成員的數量及功能仍然有待驗證。

圖7 CsPT4在不同磷水平條件下的表達分析（平均值±標準差，P＜0.05）Fig. 7 Expression analysis of CsPT4 under different P treatments (Mean±SD, P＜0.05)

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Molecular Cloning, Subcellular Localization and Expression Analysis of CsPT4 Gene in Tea Plant (Camellia sinensis)

XIN Huahong, WANG Weidong, WANG Mingle, MA Qingping, GAN Yudi, LI Xinghui*

Tea Research Institute，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095, China

Phosphate transporter proteins (Phts) play important roles in plant phosphorus (P) absorption and transportation. Furthermore, Phts affect usage efficiency of the tea garden fertilizer. A full-length phosphate transporter complementary DNA (cDNA) CsPht1:4 (also named CsPT4) was cloned from tea plant (Camellia sinensis cv. Longjingchangye) by rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques. CsPT4 had an open reading frame of 1 620 bp (GenBank accession No. KY132100) and encoded a 539 amino acid polypeptide. Bioinformatic analyses showed that CsPT4 had a molecular weight of 59.12 kD and a theoretical isoelectric point of 8.51. The protein secondary structure was a “6+Hydrophilic+6” configuration,which was consistent with the typical structure of Phts. Subcellular localization assay showed that the CsPT4 protein localized in plasma membrane, which was consistent with the predicted results of Softberry. The expression pattern of CsPT4 gene was tissue-specific. Its transcript abundance in old leaves was much higher than that in tender leaves, stems and roots. The lowest expressionof CsPT4 gene was identified in roots. Quantitative real-time PCR showed that the gene expression trends in root and leaves were different under low-P and P-deficiency treatments. Under low-P treatment, its induced level was first increased and then decreased, with higher expression in roots than leaves. While under P-deficiency treatment, the induced expression of CsPT4 gene kept stable, with its peak in roots and leaves at 72 h and 48 h, respectively. The results of this study provided a reference for the study of the molecular mechanism of tea adaptation to low P.

tea plant (Camellia sinensis), phosphate transporter protein, gene cloning, subcellular localization, expression analysis

S571.1；Q51

A

1000-369X(2017)05-493-10

2017-04-05

2017-05-02

現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-23）、江蘇高校優勢學科建設工程資助項目、國家自然科學基金（31570691）、江蘇省科技支撐計劃（BE2009313-1）

辛華洪，男，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種和茶葉生化研究。*通訊作者：lxh@njau.edu.cn