高通量測序研究霉變黑毛茶的真菌多樣性

胥偉，姜依何，吳丹，趙仁亮，朱旗

1. 湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128

高通量測序研究霉變黑毛茶的真菌多樣性

胥偉，姜依何，吳丹，趙仁亮，朱旗*

1. 湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128

為了解高濕條件下霉變黑毛茶的微生物情況，通過人工促霉培養和Illumina Miseq高通量測序技術研究了黑毛茶霉變過程的真菌多樣性，并探討了不同OTU（Operational Taxonomic Unit）閾值劃分對真菌多樣性生物信息學分析的影響。結果表明，高濕條件下霉變黑毛茶的真菌分類學地位集中于 2門（Ascomycot, Basidiomycota）6屬（Aspergillus, Galactomyces, Ogataea, Debaryomyces, Pichia和Cryptococcus），其中曲霉屬（Aspergillus）真菌相對豐度值最大，達 98%以上。不同 OTU閾值劃分水平導致了同一樣本的分類學地位、多樣性指數及群落結構組成的分析結果存在差異。相似性0.97水平下的OTU聚類真菌群落Shannon多樣性指數為 0.15～0.43，0.99水平下 Shannon多樣性指數為 0.28～0.58。曲霉屬（Aspergillus）真菌為高濕條件下導致倉儲黑毛茶霉變的優勢真菌種群。

黑毛茶；霉變；真菌多樣性

茶樹鮮葉經殺青、揉捻、渥堆、干燥等 工序制得黑毛茶[1]，渥堆是其品質形成的關鍵工序[2]，渥堆過程中，受濕熱和微生物[3-8]的共同作用，茶葉內含物質發生一系列轉化，形成黑毛茶獨有的品質特征。由黑毛茶精制而成的黑茶產品因其良好的減肥降脂及促消化功效[9-11]而深受消費者青睞，其年產量不斷增加而成為我國第二大茶類[12]。由于黑毛茶采摘較粗老，加工成的黑毛茶需在存放1～2年才進行精制，通過精制和拼配加工成各種黑茶成品。同時，銷售后的成品黑茶，民間也有通過存放以改善其粗澀口感的習俗。但在黑毛茶倉儲或成品黑茶存放過程中，由于環境條件的變化，特別是在南方的梅雨季節，茶葉表面極易滋生霉菌，輕者有風霉味，重者失去飲用價值，甚至產生飲用安全問題。生產實踐中，在高濕條件下，黑毛茶極易因其多孔徑特點而吸濕回潮，導致微生物迅速繁殖而引起霉變[13-14]。為了解黑茶霉變的發生規律，在黑毛茶等溫吸濕模型建立的基礎上[15]，人工設定溫、濕度環境促進霉菌在黑毛茶上的生長，通過對高濕條件下霉變黑毛茶真菌多樣性的研究，為倉儲中的黑毛茶安全評估提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

湖南內銷黑毛茶（2016年 5月產于湖南省桃源縣，水分含量：(10.05±0.20)%；DNA抽提試劑盒（OMEGA-soil DNA Kit, Omega Bio-Tek, USA）；2% agarose gels（biowest agArose, biowest, Espana）；FastPfu Polymerase（FastPfu Polymerase, TransGen, China）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, Axygen, USA）；Illumina MiSeq platform（TruSeq? DNA Sample Prep Kit, Illumina, USA）。

1.2 儀器與設備

GZ-150-HSII恒溫恒濕箱，韶關市廣智科技設備有限公司；KL300 LED體式顯微鏡，LEICA； Eppendorf N13462C 移 液 器 ， Eppendorf；ABSON MiFly-6小型離心機，合肥艾本森科學儀器有限公司；Eppendorf 5430 R小型離心機，Eppendorf；Eppendorf 5424R高 速 臺 式 冷 凍 離 心 機 ， Eppendorf；NanoDrop2000超微量分光光度計，Thermo Fisher Scientific；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp? 9700型PCR儀，ABI；Illumina Miseq測序儀，Illumina；Illumina hiseq測序儀，Illumina；BioTek ELx800酶標儀 ， Biotek； TBS380 微 型 熒 光 計 ，TurnerBioSystems； Covaris M220， Gene Company Limited；QL-901旋渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；TL-48R粉碎研磨儀，上海萬柏生物科技有限公司。

1.3 促霉處理及保存

稱取黑毛茶盛于培養皿（培養皿開口，每份培養皿15 g茶樣），分5層，每層15份放置于恒溫恒濕箱，溫度 25℃，相對濕度 RH 90%。人工培養經體式顯微鏡鏡檢觀察到有霉菌菌絲存在時開始取樣，隔48 h取1次樣品，共獲得培養至第 3、5、7、9、11、13、15 d的樣品，分層取樣并迅速置于無菌袋中混合均勻密封保存（樣品編號分別為：1、2、3、4、5、6、7），－20℃凍存。

1.4 基因組DNA提取

參考葛英亮[16]的方法采用 E.Z.N.A. Soil DNA基因組提取試劑盒進行基因組 DNA的提取，－20℃凍存。電泳檢測參數：瓊脂糖凝膠1%，電場強度：5 V·cm-1，時間30 min。

1.5 18 S rDNA PCR擴增

參考Wei Zhang[17]的方法進行18 S r DNA PCR擴增，參數調整如下。

反 應 體 系 ： 引 物 ： SSU0817F: 5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3', 1196R: 5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'；5×FastPfu Buffer，4 μL；2.5 mmol·L-1dNTPs，2 μL；Forward Primer (5 mmol·L-1)，0.8 μL； Reverse Primer (5 μmol·L-1)，0.8 μL；FastPfu Polymerase，0.4 μL；BSA，0.2 μL；Template DNA，10 ng；ddH2O補至20 μL。反應參數：95℃變性3 min；以95℃ 30 s，55℃，30 s，72℃，45 s擴增35個循環；72～10℃，10 min。

1.6 Miseq高通量測序

Illumina MiSeq高通量基因測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.7 測序數據優化與統計

Illumina高通量測序平臺測序得到的序列數據，首先根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接（merge）成1條序列，同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾，根據序列首尾兩端的barcode和引物序列區分樣品得到有效序列，并校正序列方向。數據去雜方法和參數：過濾read尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于 20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的read；根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成 1條序列，最小 overlap長度為10 bp；拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為 0.2，篩選不符合序列；根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為 0，最大引物錯配數為2。軟件平臺：Trimmomatic、FLASH。該工作委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.8 物種注釋

采用RDP classifier貝葉斯算法[18]分別對97%和99%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析[19]，并在各個分類學水平統計每個樣品的群落組成。軟件平臺：Qiime[20]。生物信息學分析工作委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.9 多樣性指數計算

霉變黑毛茶真菌多樣性指標：采用 Chao指數和 Ace指數計算菌群豐富度；采用Shannon指數和 Simpson指數計算菌群多樣性；采用 Coverage指數計算測序深度。軟件平臺：mothur version v.1.30.1[21]。

2 結果與分析

2.1 人工促霉培養黑毛茶茶樣鏡檢結果

采用恒溫恒濕培養的方法模擬高濕條件下的黑毛茶倉儲進行促霉培養，每隔24 h進行1次體式顯微觀察，培養至72 h時，黑毛茶表面在體式顯微鏡下可觀察到霉菌菌絲，表明高濕條件下霉菌菌絲開始在黑毛茶表面生長。體式顯微鏡可觀察到霉菌菌絲在茶葉表面交織生長，隨著培養時間的延長，霉菌菌絲開始特異化形成孢囊梗并產生產孢結構（圖1）。

2.2 不同樣品優化序列及OTU統計信息

采用Illumina Miseq高通量測序技術檢測了黑毛茶霉變過程的真菌種群，通過對真菌18 S區進行測序，設置不同相似度水平值（0.97，0.99）進行歸類操作。去除嵌合體和沒有重復的單序列，0.97相似水平下7個樣品共獲得257 471條tags，被歸類于7個OTUs（圖2）。樣品tags數隨霉變時間的變化見圖3，平均 tags數為 36 782±3 858。0.99相似水平下 7個樣品共獲得 234 122條 tags，被歸類于25個OTUs（圖2），樣品tags數隨霉變時間的變化見圖 3，平均 tags數為 33 446 ±3 844。優化后測序數據序列堿基長度401～420 bp的序列達262 107條，約占總序列的99.91%。

2.3 霉變黑毛茶的OTU及分類學地位統計

將通過Illumina Miseq高通量測序所得的序列優化后比對至OTU代表序列，生成OTU表格，優選 OTU 序列檢索數據庫https://unite.ut.ee/index.php進行分類學地位統計，分類學地位對比情況見表1。

圖1 高濕條件下不同培養時間的黑毛茶體式顯微鏡檢圖Fig. 1 The Stereomicroscope examination of raw dark tea under high humidity during different culture times

圖2 不同相似水平下不同霉變時間的OTUs值Fig. 2 The OTUs of different mildew time under different similarity levels

圖3 不同霉變時間樣品的Tags值Fig. 3 The tags of different mildew times

基于不同相似水平（0.97, 0.99）進行歸類操作形成的OTU單元存在較大差別，相似水平提高后獲得的總OTU值減少，但OTU種類數增加至3倍左右，有利于真菌種群的分析及多樣性計算。Illumina Miseq高通量測序技術基于 18 S rDNA測序數據檢索數據庫得出分類學地位及多樣性指數，目前普遍認為該方法在 0.97的相似水平下得出的屬水平分類學地位較可靠[16,22-24]。從霉變過程取得的7個黑毛茶樣品真菌種群變化不大，基于 0.97相似水平得出的屬水平分類學地位有：曲霉屬（Aspergillus）、地霉屬（Galactomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、隱球菌屬（Cryptococcus）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）；基于0.99相似水平得出的屬水平分類學地位有：曲霉屬（Aspergillus）、甲醇誘導型酵母屬（Ogataea）、畢赤酵母屬（Pichia）、地霉屬（Galactomyces）、隱球菌屬（Cryptococcus）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）。對比可發現提高相似水平值后新增加了甲醇誘導型酵母屬（Ogataea）真菌。原因在于此屬物種序列與 0.97水平下注釋出的真菌種群中某個屬的序列水平相似度很高，不能被區分。黑毛茶的霉變過程真菌種群變化不大，并表現出越往后期種群數量越單一的規律，這可能與本研究設置的霉變條件有較大關系，該霉變條件下某類真菌較優的適應了該環境而得到生長繁殖，在與其他物種競爭過程中取得了優勢。

表1 霉變黑毛茶的真菌多樣性分類學地位統計Table 1 Taxonomic status of the fungi diversity in mildew dark tea

2.4 霉變黑毛茶的Alpha多樣性指數

通過Alpha多樣性指數可以反映各樣品之間微生物群落的豐度和多樣性指數的差異。Alpha 多樣性指數的計算要求測序深度能夠覆蓋整個微生物群落。物種觀測稀釋性曲線[25]表明，觀測到OTU數量隨著隨機抽取的測序數量的增加而逐漸呈現水平趨勢（圖4），表明測序數據量合理，其數據可以反映樣本真實多樣性情況。基于不同相似水平（0.97, 0.99）形成的歸類操作單元進行多樣性指數計算統計數據見表2。

圖4 不同相似水平下觀測指數稀釋性曲線Fig. 4 The morphology microscopic observations of raw dark tea under different similarity levels

表2 霉變黑毛茶真菌群落Alpha多樣性指數Table 2 Alpha community diversity index of gungus in mildew dark tea

Alpha多樣性分析檢驗用來估計樣品微生物群落的物種豐富度和多樣性，包括 Ace、Chao、Coverage、Shannon、Simpson等統計學分析指數。Coverage值均高達0.999以上，表明本次測序對樣品中真菌的覆蓋率很高，證明選擇測序深度適合，可以滿足樣品中真菌多樣性分析的需要；Ace指數和Chao指數反應出霉變過程真菌群落豐富度較低，Shannon指數和 Simpson指數則表明黑毛茶霉變過程真菌多樣性程度較低；同時提高相似水平值后的Ace指數和Chao指數均有所提高，Shannon指數有所提高，Simpson指數有所降低。相似水平提高后進行歸類操作形成的 OTU統計分析得出的Alpha值與理論值相吻合。多樣性指數的統計結果與分類學地位的統計數據相匹配，表明黑毛茶在高濕條件下的霉變過程中真菌種群豐度和多樣性指數都有所降低，可為黑茶的霉變防范、預測及安全評價提供相關依據。

2.5 霉變黑毛茶的真菌群落組成分析

基于不同相似水平（0.97，0.99）形成的歸類操作單元進行群落組成分析、真菌群落相關性分析及樣本間相關性分析，具體統計見群落組成圖（圖5）、群落Heatmap圖（圖6），真菌群落組成分析統計數據見表3（可注釋分類學地位）及表4（未注釋出分類學地位）。

圖5 基于屬水平霉變黑毛茶不同相似水平真菌群落結構Fig. 5 Genus-level community structure of fungus in mildew raw dark tea based on different similar levels

圖6 基于屬水平霉變黑毛茶不同相似水平真菌群落Heatmap圖Fig. 6 Genus-level community heatmap of fungus in mildew raw dark tea based on different similar levels

不同相似度水平下的注釋結果均表明霉變過程的黑毛茶樣品真菌種群主要為曲霉屬（Aspergillus）真菌，占比達98%以上，其次為德巴利酵母屬（Debaryomyces）真菌（表3）。0.99相似度水平的物種注釋結果較 0.97水平下豐富（表3），新增甲醇誘導型酵母屬（Ogataea）（表3）真菌注釋結果及未能清晰注釋的 Ascomycota unclassified、Eurotiales unclassified和Trichocomaceae unclassified（表4）等3個屬的真菌。從研究材料考慮，黑毛茶霉變過程以占絕對優勢的曲霉屬（Aspergillus）真菌所表征，清晰闡述該屬真菌的具體種類及生物學特性是黑茶倉儲及安全評價亟待解決的問題。從研究方法考慮，基于0.97的相似度水平對于真菌18 S條帶的物種注釋存在一定的局限性，18 S r DNA為高度保守序列，在進化過程中變異程度低，較難區分注釋親緣關系較近的真菌種群分類學地位。

表3 霉變黑毛茶的真菌群落組成（可注釋）Table 3 The fungal community composition in mildew dark tea (can be noted)

表4 霉變黑毛茶的真菌群落組成（未能注釋）Table 4 The fungal community composition in mildew dark tea (can not be noted)

黑毛茶霉變過程真菌多樣性及豐度變化見Heatmap圖（圖6），橫軸樣品為不同霉變時間的黑毛茶樣品，縱軸顯示各屬真菌種類，不同顏色表示各屬真菌在樣品中的豐度，圖上方進化樹表明樣品間的相似程度：0.99相似度水平下的進化樹聚類分析結果更能還原實際樣本情況，1號樣品為一類，2、3、4、5、6、7號樣品為一類，表明相似度水平越高，樣本間聚類分析結果更科學。該進化樹聚類分析表明黑毛茶霉變初期（1～3 d）真菌種群變化迅速，第5天開始種群多樣性變化速度減緩，多樣性呈逐漸下降趨勢，至第15天時最低，這與Alpha多樣性指數結果相一致。該結果表明隨著霉變時間的延長，適宜室溫高濕條件下的曲霉屬（Aspergillus）真菌得到生長繁殖，其他類真菌種群生長受到相對抑制。圖左側進化樹將曲霉屬（Aspergillus）真菌聚為一類，并與其他類真菌有較遠的遺傳距離，在霉變進程中屬于絕對優勢真菌種群。在所檢樣品中，許多豐度極低的酵母屬真菌種群亦被檢出，表明高通量測序技術能檢測出樣本中含量極微的真菌種群信息，對分析種群多樣性有著傳統分析方法無法比擬的優越性。

3 討論

黑茶微生物學的研究多基于微生物與其品質形成機理的相互關系開展微生物的種群鑒定及功能注釋等方面的研究[3-7]，但鮮見黑茶生霉劣變過程中的真菌種群多樣性分析及物種注釋。采用高通量測序技術直接從樣本中提取微生物基因組總DNA，并對18 S條帶進行特異性擴增，解決了不可培養及低豐度真菌在傳統方法中無法檢出的局限。如形態學鑒定法對貯藏期的黑茶樣本進行研究僅發現黑曲霉（Aspergillus niger）、灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）、 產 黃 青 霉 （ Penicillium chrysogenum）、根霉屬（Rhizopus spp.）、木霉屬（Trichoderma spp.）、酵母（分類學地位未知）等真菌種群[26-28]。本方法基于Miseq平臺測序技術，研究了高濕條件下黑茶霉變的主要真菌種群結構和多樣性特性，不僅了解了黑毛茶霉變過程中主要真菌種群為曲霉屬（Aspergillus），而且解析出其豐度值高達98%以上，同時低豐度的甲醇誘導型酵母屬（Ogataea）、畢赤酵母屬（Pichia）、地霉屬（Galactomyces）、隱球菌屬（Cryptococcus）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）等真菌亦有檢出，這與Abe M等[3]和Xu A等[5]采用DGGE技術鑒定貯藏期茯磚茶和普洱茶的結果較一致，但更加全面地揭示出低豐度地霉屬（Galactomyces）、甲醇誘導型酵母屬（Ogataea）、隱球菌屬（Cryptococcus）等真菌種群，表明該研究方法具有傳統鑒定法無法比擬的優勢，這與陳慶金等[29]的觀點一致。

基于0.97的相似度水平下多樣性 Shannon指數為 0.15～0.43，Simpson 指數 0.7449～0.9492；基于 0.99的相似度水平下多樣性Shannon指數為0.28～0.58，Simpson指數0.7007～0.9032，該結果表明曲霉屬（Aspergillus）真菌是黑毛茶霉變過程中霉菌的優勢菌群。陳建玲等[30]曾報道了普洱茶在高濕條件下的真菌毒素含量，從食品安全的角度而言，我們需要防范高濕條件下曲霉屬真菌可能產生的真菌毒素給消費者帶來的安全隱患。高濕條件下，曲霉屬真菌代謝繁殖，使之成為黑毛茶霉變過程的絕對優勢真菌種群，并隨著霉變程度的增加使之在真菌菌群多樣性結構中的豐度進一步加大。而黑毛茶霉變過程中霉菌的具體種名及豐度動態變化需要進一步研究。

需要留意的是，從我們已進行的感官審評和傳統形態分類學方面的鑒定工作來看，人工促霉的黑茶樣本和存放環境不當所導致的黑毛茶自然霉變樣本真菌種群存在差異，考慮霉變真菌種群受到樣本所處環境中的微生物菌群、環境基質及外界條件等共同影響，該部分內容將在以后的工作中進行系統研究。

基于高通量測序結果的物種注釋在 OTU閾值劃分時需要留意，不同的OTU閾值劃分對物種的分類學結果及多樣性指數會帶來一定的影響，特別是對豐度低的物種和樣本間聚類分析進行研究時建議提高相似度水平，有利于同源性高的物種和豐度低的物種注釋出分類學結果，也有利于樣本間相似度分析時的結果更科學。

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RNA Sequencing Analysis of Fungi Community Diversity in Mildew Raw Dark Tea

XU Wei, JIANG Yihe, WU Dan, ZHAO Renliang, ZHU Qi*

1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

In order to understand the feature of microbe in the mildew dark tea under high humidity conditions, Illumina Miseq high-throughput sequencing was performed to study fungi diversity by artificial culture of certain fungi. The influence of the OTU (Operational Taxonomic Unit) threshold on the bioinformatic analysis results of fungal diversity was also discussed. The results showed that the mildew dark tea fungus under high humidity conditions were mainly classified into 2 phylum (Ascomycota, Basidiomycota) and 6 genera (Aspergillus, Galactomyces, Ogataea, Debaryomyces, Pichia and Cryptococcus), with the highest abundance value of Aspergillus (＞98%). The different OTU thresholds resulted in the difference in the taxonomic status, diversity index and community structure in the same sample. The Shannon diversity index of OTU under the 0.97 was 0.15-0.43, and the Shannon diversity index under 0.99 was 0.28-0.58. Under high moisture conditions aspergillus was the major fungi causing dark tea mildew in storage.

raw dark tea, mildew, fungi community diversity

TS272.5+4；Q949.32

A

1000-369X（2017）05-483-10

2017-02-28

2017-05-04

國家自然科學基金（31571802）、湖南省教育廳重點項目（14A066）、湖南省研究生科研創新項目（CX2016B283）

胥偉，男，博士研究生，主要從事茶葉加工及功能成分化學研究。*通訊作者：1965994459@qq.com