飼料復合微生物發酵菌種比例的篩選研究

王小明，楊在賓*，劉曉明，李兆勇，李祥明

（1.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018；2.北京科為博生物科技有限公司，北京 100193；3.山東省飼料質量檢驗所，山東 濟南 250022）

飼料復合微生物發酵菌種比例的篩選研究

王小明1，楊在賓1*，劉曉明1，李兆勇2，李祥明3

（1.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018；2.北京科為博生物科技有限公司，北京 100193；3.山東省飼料質量檢驗所，山東 濟南 250022）

本文旨在研究乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復合發酵對飼料pH、干物質回收率（DMR）和還原糖含量的影響，探討菌種的適宜添加比例。以乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的不同添加比例為因素（每個因素3個水平），設計9組發酵模型，35～37 ℃固態發酵，每12 h檢測一次pH，取發酵0 h、24 h、48 h和72 h樣品進行還原糖含量和DMR的檢測。結果表明：在相同時間內，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌添加比例為2∶2∶2或2∶2∶3，飼料pH較低，發酵進程較快（P＜0.05）；添加比例為2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3，飼料發酵后還原糖的含量顯著提高（P＜0.05）；發酵72 h，各處理之間飼料DMR差異不顯著（P＞0.05），飼料干物質損失平均為6.15%。本試驗條件下，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復合發酵的適宜添加比例為2∶2∶2。

復合微生物發酵；pH；還原糖；干物質回收率

微生物發酵產生的大量有機酸和消化酶，能夠抑制或殺死有害菌，維持動物腸道菌群的生態平衡，促進腸道健康和飼料消化，提高動物的生產性能[1-2]。研究報道，枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌組合發酵豆粕，能夠提高豆粕的氨基酸含量[3]；植物乳酸桿菌、芽胞桿菌和酵母菌復合發酵能夠改善飼料營養成分，提高飼料營養消化率[4]。微生物群落的生物多樣性，可以影響發酵系統的功能，且發酵基質中各菌群彼此間相互依存、共同作用[5]。復合益生菌發酵不僅能夠提高飼料消化率，而且由于益生菌大量繁殖，使發酵飼料兼有益生菌添加劑的特點[6]。目前的研究重點主要集中在微生物發酵單一原料及發酵后營養物質的變化分析，對于應用乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復合發酵配合飼料及研究其添加比例的報道較少，且大部分試驗研究參數是基于實驗室條件，與實際生產需求存在一定差距。因此，本試驗模擬實際生產條件，通過研究微生物復合發酵對飼料pH、還原糖含量和干物質回收率的影響，探討乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復合發酵的適宜添加比例，為發酵飼料的科學生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發酵菌種：乳酸菌（Lactobacillus），5×109CFU/g； 酵 母 菌（Yeast），4.6×109CFU/g；枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis），1.9×1010CFU/g；北京科為博生物科技有限公司提供。

發酵基質：玉米-豆粕型基礎日糧，日糧配方設計參照NRC（1998）生長豬標準配制，日糧配方組成及營養水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養水平（風干基礎，%）

表2 試驗設計

表3 復合微生物發酵飼料pH的變化規律

1.2 試驗設計

以乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為3個因素，每個因素3個水平，設計9組發酵模型（表2）。

1.3 試驗方法

將發酵菌種與發酵基質混合，加水調節至水分含量為45%，攪拌均勻，裝入塑料桶（20 kg），密封發酵，發酵溫度控制在30～35 ℃。每個處理8個重復，0 h開始，每12 h取樣檢測pH（每個重復3個平行），連續測定8次。取發酵0 h、24 h、48 h和72 h樣品，進行還原糖含量和干物質回收率（dry matter recovery，DMR） 的測定。

1.4 樣品檢測

1）pH：根據AACC（2000）的方法[7]，稱取10 g發酵樣品，放入三角瓶中，加入90 mL蒸餾水。用磁力攪拌器攪拌30 min，靜置10 min后用pH計測定。重復3次取平均值。

2）還原糖（reducing sugar）含量：采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定[8]。

3）干物質回收率（dry matter recovery，DMR）：按飼料發酵前后重量和干物質（DM）含量計算[9]。

1.5 數據處理

數據處理采用SAS 9.2的ANOVA進行方差分析，Duncan 氏進行多重比較；采用Origin 9.1進行二次線性擬合（f(x)=ax2+bx+c），a為二次項系數，b為一次項系數，c為常數項。P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 飼料pH的變化

各組飼料pH的變化規律見表3、表4。從表中可以看出：不同處理組的飼料pH逐漸降低，隨著發酵的進行降低逐漸減緩，且均呈現二次曲線規律（P＜0.001）。飼料pH擬合方程的二次項系數a和一次項系數b，各處理之間差異極顯著（P＜0.01）；常數項c值，各組之間差異不顯著（P＞0.05）。其中，A2和A5組a值略高于其他組，但二者之間差異不顯著（P＞0.05）。從發酵開始到飼料pH基本穩定，擬合方程的二次項系數a值越大，降低相同pH所需的時間越短。由以上分析可知，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為2∶2∶2或2∶2∶3，在相同時間內，飼料pH較低，發酵進程較快。

表4 復合微生物發酵飼料pH擬合曲線變化規律

表5 復合微生物發酵飼料還原糖含量的分析 %

表6 復合微生物發酵飼料干物質回收率的分析 %

2.2 飼料還原糖含量的變化

飼料還原糖含量的測定結果見表5。由表5可知：在發酵過程中添加不同比例的乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌，能夠顯著提高發酵后飼料的還原糖含量（P＜0.05），隨著發酵的進行還原糖含量的增加減緩。其中，A2組、A3組和A5組相比較，飼料還原糖含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他處理組（P＜0.05）。由此可知，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3，均能夠明顯提高飼料發酵后還原糖的含量。

2.3 飼料DMR的變化

乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復合發酵，飼料DMR的比較分析見表6。從表中可以看出：飼料經過微生物發酵后，具有一定程度的干物質損失，隨著發酵時間的延長干物質損失增加緩慢。其中，飼料發酵24 h，各組間的飼料DMR無顯著差異（P＜0.05）；發酵48 h，A9組飼料DMR顯著低于其他組（P＜0.05）；發酵72 h各組的飼料DMR彼此之間差異不顯著（P＞0.05），干物質的損失量平均為6.15%。

3 討論

3.1 復合微生物發酵對飼料pH的影響

發酵過程中酸含量的增加有利于飼料的長期保存，且飼料pH的降低與酸含量的增加有直接關系[5，10]，因此pH能夠反映飼料發酵后的酸含量水平。乳酸菌在發酵過程中能夠利用碳水化合物等營養物質，產生乳酸、醋酸等有機酸，降低底物的pH[10]。Alvarez-Martin等[11]通過混合培養研究酵母菌和乳酸菌的生長活動及其相互作用，發現酵母菌和乳酸菌混合發酵可以調控代謝產物的變化，酵母菌能夠通過與乳酸菌的共生作用刺激乳酸菌活動，從而促進乳酸的產生及pH的降低。枯草芽孢桿菌能夠代謝產生乳酸等有機酸，同時消耗環境中的游離氧，創造厭氧條件，促進乳酸菌的大量繁殖并產生乳酸，降低pH[12]。本試驗研究結果表明，添加乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌后，隨著發酵時間的增加，飼料pH逐漸降低，并呈二次曲線的規律。其中，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為2∶2∶2或2∶2∶3時，飼料的pH降低速度最快，發酵進程最快。從而推測乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌按照一定的比例組合混合發酵，能夠充分利用彼此間的協同性、互補性，發揮組合正效應，促進乳酸等有機酸的產生，降低飼料pH。隨著發酵時間的延長，pH下降緩慢，維持在一定水平。這可能是隨著pH的降低，發酵產生的有機酸積累到一定程度，優勢菌群（乳酸菌等）的生存受到的酸抑制作用增強，活性逐漸減弱，從而造成產酸能力下降。

3.2 復合微生物發酵對飼料還原糖的影響

微生物在生長過程中產生的酶可以降解飼料中的營養物質，部分與氨基酸結合的還原糖得到釋放，從而提高碳水化合物的利用率。枯草芽孢桿菌在發酵過程中產生纖維素酶，降解發酵基質中的纖維素，提高還原糖含量。微生物發酵產生的淀粉酶可以有效降解淀粉為單糖，提高還原糖的含量[13]。閆亞婷等[14]利用枯草芽孢桿菌發酵玉米粉，發現與對照組相比玉米粉的中性洗滌纖維下降了4.67%，酸性洗滌纖維下降了41.63%，發酵產物中還原糖質量分數提高了2.1倍。Chumchuere[15]等、Wang[16]等 人 研究報道，隨著發酵時間的延長，豆粕中葡萄糖、果糖和半乳糖等還原糖的含量會增加趨緩。本研究結果表明，飼料經微生物發酵后，還原糖的含量顯著提高，且乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3，飼料的還原糖含量最高。按一定比例組合的乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌，隨著發酵進行，溫度升高，pH下降，產酸增加，酶促反應加快，促進纖維素和淀粉的降解，進一步提高單糖等還原糖的含量，提高飼料的利用率。隨著時間的延長，飼料還原糖的增加趨緩，最終維持穩定。可能的原因是隨著飼料pH的降低，枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌的活性受到抑制，分泌的酶類減少，同時纖維素酶和淀粉酶等的降解能力受到抑制。

3.3 復合微生物發酵對飼料DMR的影響

干物質損失是指微生物消耗發酵基質的營養物質用于維持自身的生長繁殖，部分能量在轉化過程中以熱能的形式散失[13]。DMR表示發酵過程中養分的損失程度，其數值越高，說明發酵損失越小，營養物質的降解越少。本研究中，發酵72 h，各處理組間的飼料DMR并無顯著差異，但平均干物質的損失量在6.15%。這與丁雪等[17]的研究結果基本相符，隨著時間的延長，干物質損失持續增加，最大的干物質損失為19.73%。

4 結論

在本試驗條件下，復合微生物能夠有效加快發酵進程，提高飼料還原糖含量，發揮出組合正效應。相同時間內，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌添加比例為2∶2∶2或2∶2∶3，飼料pH最低，發酵進程最快；添加比例為2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3時，能夠顯著提高飼料發酵后的還原糖含量；發酵72 h后，飼料的干物質回收率差異并不明顯，干物質損失量平均在6.15%。

綜上所述，在本試驗條件下，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復合發酵飼料的適宜添加比例為2∶2∶2。

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2017-07-05）

山東省現代農業產業技術體系生豬創新團隊建設項目SDAIT-08-04

* 通訊作者：楊在賓（1961-），男，教授，博士生導師，研究方向：動物營養與飼料科學，E-mail：yzb204@163.com