營養(yǎng)和蒎烯脅迫條件下松材線蟲雌雄比變化規(guī)律*

王 璇 理永霞 張星耀

(森林病原整合生物學(xué)研究室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所 北京 100091； 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037)

營養(yǎng)和蒎烯脅迫條件下松材線蟲雌雄比變化規(guī)律*

王 璇 理永霞 張星耀

(森林病原整合生物學(xué)研究室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所 北京 100091； 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037)

【目的】 研究松材線蟲不同環(huán)境條件下繁殖策略，為該病種群擴(kuò)張繁殖生物學(xué)的深入研究和防控策略的制定提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā?通過顯微觀察檢測在營養(yǎng)和蒎烯脅迫條件下松材線蟲雌雄比變化規(guī)律?！窘Y(jié)果】 在營養(yǎng)富足條件下，松材線蟲雌蟲比例增加，反之松材線蟲雄蟲比例增高； 低濃度α-蒎烯和β-蒎烯脅迫條件下，松材線蟲雌雄比降低，而高濃度α-蒎烯處理后，松材線蟲雌雄比升高，雌性后代比例增大； 在低濃度α-蒎烯和低濃度β-蒎烯混合處理條件下，松材線蟲雌雄比最低，且一直穩(wěn)定在較低水平。【結(jié)論】 松材線蟲在適宜環(huán)境條件下有利于雌性后代的發(fā)育，而不適宜環(huán)境條件下雄性后代發(fā)育更快，因此，松材線蟲可能通過種群雌雄比來調(diào)整其種群繁殖力，從而適應(yīng)不同環(huán)境的變化。

松材線蟲； 繁殖生物學(xué)； 繁殖對策； 雌雄比； 繁殖率

Abstract： 【Objective】 The sex ratio is one of the determining factors of the nematode reproduction rate that is key for the pathogenicity, and population expansion of pine wood nematode,Bursaphelenchusxylophilus. This study aims to survey the reproductive tactics of PWN under different cultural conditions for providing a theoretical basis for futher study on the population expansion relatived to reproductive behavior and strategy for prevention and control of pine wood disease.【Method】 We investigated the change pattern of PWN female to male ratio under different nutritional conditions and pinene stress by micro-examination.【Result】 The sex ratios were biased to females at nutrition-rich conditions and the nematodes exercised a masculinizing effect on the developing larvae in poor nutrition environments. The α-pinene and β-pinene were ableto inhibit the nematode’s reproductive rate with low sex ratio at low concentration but promote the rate at high concentration with high sex ratio. The β-pinene might inhibit the reproduction potential with low sex ratio at low and high concentration. The sex ratio was lowest and relatively stable under the mixture stress of low concentration α-pinene and β-pinene.【Conclusion】 The PWN sex ratios were biased to females at favorable environmental conditions and the nematodes exercised a masculinizing effect on the developing larvae in uncomfortable environments. Thus we infer that the PWN would control the reproduction rate by modifying the sex ratio to adapt the environment change.

Keywords： pine wood nematode； reproductive behavior； reproductive tactics； sex ratio； reproduction ratio

松材線蟲病，即松樹萎蔫病(pine wilt disease，PWD)，是一種以松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)(Nickleetal., 1981)為病原，墨天牛屬昆蟲(Monochamusspp.)(Mamiya, 1983)為主要媒介，寄主松樹(Pinus)、相關(guān)伴生菌和環(huán)境因素互作的復(fù)雜病害系統(tǒng)(張星耀等， 2003)。該病傳播蔓延迅速，防治難度極大，是我國目前最為嚴(yán)重的森林災(zāi)害。

松材線蟲繁殖率是影響其致病性的關(guān)鍵因素，而雌雄比是決定種群繁殖率的重要因素之一。線蟲能通過改變雌雄比調(diào)整群體繁殖率從而適應(yīng)不同環(huán)境(Blackmoreetal., 1989)。關(guān)于松材線蟲在不同環(huán)境條件下的雌雄比動態(tài)變化的報道較少，研究發(fā)現(xiàn)溫度能影響松材線蟲雌雄比和繁殖潛力(Heipetal., 1978)，在一定范圍內(nèi)，溫度越高，松材線蟲活性越高，生殖能力越強(qiáng)。松材線蟲在雌雄比較高時繁殖能力較高(Rutherfordetal., 1992)，其雌雄比為3.4時繁殖效率最高(劉寶軍， 2014)：松材線蟲雌雄比還會隨著化學(xué)物質(zhì)脅迫(黃曉娟， 2014)，光照脅迫(張?zhí)飯@， 2014)等培養(yǎng)條件的變化而變化。

松材線蟲侵染后，線蟲取食松樹薄壁細(xì)胞引起松樹萜烯類物質(zhì)代謝紊亂，松樹樹脂道內(nèi)大量積累單萜、倍半萜等物質(zhì)(Kuroda, 1989; Haraetal., 2006)。松樹釋放的單萜類物質(zhì)主要是α-蒎烯和β-蒎烯。低濃度的α-蒎烯和β-蒎烯會抑制松材線蟲繁殖，而高濃度時能促進(jìn)松材線蟲繁殖(Niuetal., 2012)。同時，隨著松材線蟲的入侵，群體數(shù)量急劇增加，松材線蟲將面臨不同的營養(yǎng)環(huán)境。松材線蟲在樹體內(nèi)的成功定殖后，會面臨不同的營養(yǎng)環(huán)境，同時也必須克服松樹萜烯類次級代謝產(chǎn)物的抑制作用。因此，為了探討松材線蟲病的擴(kuò)張機(jī)制，了解影響松材線蟲繁殖的因素及其變化規(guī)律，為調(diào)控松材線蟲病發(fā)生提供理論依據(jù)，筆者研究了松材線蟲在不同營養(yǎng)環(huán)境和蒎烯脅迫條件下的雌雄比變化。

1 材料與方法

1.1 松材線蟲培養(yǎng)和收集 供試高致病性松材線蟲來自于本實(shí)驗所保存的Nxy61蟲株，該蟲株分離于2012年10月浙江寧波當(dāng)年發(fā)病的馬尾松(Pinusmassoniana)枝條，通過貝爾曼漏斗法分離后用玉米(Zeamays)培養(yǎng)基長期保存。試驗接種線蟲為混合蟲態(tài)松材線蟲(包括蟲卵、2～4齡幼蟲以及成蟲)，在PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基上25 ℃黑暗培養(yǎng)7天后，通過貝爾曼漏斗法分離線蟲，5 000 r·min-1離心5 min，無菌水清洗3遍，通過光學(xué)顯微鏡統(tǒng)計線蟲懸浮液中雌蟲和雄蟲數(shù)量，并加入相應(yīng)數(shù)量的雌蟲或雄蟲來調(diào)整線蟲懸浮液雌雄比為1.5，最后用無菌水調(diào)整線蟲懸浮液濃度為15 000頭·mL。

1.2 松材線蟲性別比計數(shù) 200 μL線蟲懸浮液(3 000頭)接種于直徑為9 cm PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)。分別培養(yǎng)2、3、4、5、6、7和8天后，用無菌水沖洗3次，完全收集平板上的線蟲，5 000 r·min-1離心5 min后，統(tǒng)計每個平板上線蟲后代的雌雄比。計數(shù)時觀察到陰門的4齡幼蟲和成蟲計為雌蟲，有交合刺的計為雄蟲。每個試驗處理重復(fù)4次，每個平板計數(shù)不少于500頭線蟲。

1.3 PDA灰葡萄培養(yǎng)基上雌雄比變化檢測 為了研究松材線蟲在PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基上雌雄比變化規(guī)律，將3 000頭混合蟲態(tài)的松材線蟲接種于直徑為9 cm的PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基上，根據(jù)1.2中雌雄比計數(shù)方法分別統(tǒng)計接種后2、3、4、5、6、7、8、10和15天時的線蟲后代雌雄比。

1.4 不同培養(yǎng)基上雌雄比變化檢測 為了研究松材線蟲在不同營養(yǎng)條件下的雌雄比變化規(guī)律，分別制備了不同營養(yǎng)條件的培養(yǎng)基： PDA(200 g馬鈴薯； 20 g葡萄糖； 17 g瓊脂)、HPDA(100 g馬鈴薯； 10 g葡萄糖； 17 g瓊脂)、PA(200 g馬鈴薯； 17 g瓊脂)、DA(20 g葡萄糖； 17 g瓊脂)、WA(17 g瓊脂)。不同培養(yǎng)基上接種相同大小的灰葡萄孢菌絲體，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后，完全刮取培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌絲，烘干后稱量其干質(zhì)量，得到不同培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌絲生物量。同時，接種200 μL雌雄比為1.5的線蟲懸浮液(15 000頭·mL-1)到不同營養(yǎng)含量的灰葡萄孢培養(yǎng)基上，根據(jù)1.3節(jié)方法統(tǒng)計接種后2、3、4、5、6、7和8天時不同營養(yǎng)培養(yǎng)基上的線蟲后代雌雄比。

1.5 不同萜烯類物質(zhì)處理條件下松材線蟲雌雄比檢測 不同濃度蒎烯的制備： 以Triton X-100為乳化劑制備不同濃度的α-蒎烯(Acros Organics, Purity 97%)和β-蒎烯(Alfa Aesar, Purity 99%)以及其混合物的蒎烯溶液(Choi, 2007)。其中α-蒎烯濃度分別是56.33 mg·mL-1(low concentration α-pinene,AL)和214.5 mg·mL-1(high concentration α-pinen,AH)，β-蒎烯濃度分別是21.66 mg·mL-1(low concentrationβ-pinene,BL)與214.5 mg·mL-1(high concentration β-pinene,BH)，兩者混合物(mixture of α-pienene and β-pienene,M)中α-蒎烯濃度為56.33 mg·mL-1，β-蒎烯濃度為21.66 mg·mL-1，對照組(CK)為0.5%的Triton X-100(m/m)。

蒎烯脅迫的雌雄比檢測： 采用棉球生測法(Kongetal., 2007)測定不同萜烯類物質(zhì)對松材線蟲雌雄比的影響。在培養(yǎng)好的灰葡萄孢平板(9 cm)中央用0.5 cm無菌打孔器打孔，放入無菌脫脂棉球(5 mm直徑)后，加入200 μL線蟲液(15 000頭·mL-1)后，加入50 μL不同濃度的萜烯溶液，對照加入50 μL的0.5%Triton X-100(m/m)溶液，封口膜封口后，25 ℃黑暗培養(yǎng)，根據(jù)1.3節(jié)方法分別計數(shù)接種后第2、3、4、5、6、7和8天的松材線蟲雌雄比。

1.6 數(shù)據(jù)分析 所有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均用SPSS19.0分析。通過方差分析不同處理條件下的平均值顯著性，所有作圖數(shù)據(jù)均用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDA真菌培養(yǎng)基上松材線蟲雌雄比 松材線蟲接種PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基后，松材線蟲雌雄比第3天最大，大約為3。接種后第7天時松材線蟲雌雄比降低為1.5，一直到接種后的15天，松材線蟲雌雄比保持在1.2～1.5。接種后期，隨著培養(yǎng)時間的延長，松材線蟲雌雄比變化較小，且比較穩(wěn)定(圖1)。

圖1 PDA培養(yǎng)基上松材線蟲雌雄比Fig.1 The sex ratio of PWN on the PDA fungi media

圖3 不同營養(yǎng)培養(yǎng)基上松材線蟲雌雄比Fig.3 The sex ratio of PWN on the different nutrition media

2.2 不同營養(yǎng)培養(yǎng)基上松材線蟲雌雄比 由于5種培養(yǎng)基營養(yǎng)成分含量不同，接種相同數(shù)量的菌絲體7天后，5種培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌絲生物量存在差異，從高到低依次是PDA、HPDA、PA、DA和WA，其中PDA與PA、DA和WA培養(yǎng)基上菌絲生物量差異顯著(圖2)。接種相同數(shù)量的混合蟲態(tài)松材線蟲懸浮液后，松材線蟲在PDA培養(yǎng)基上的雌雄比最高，在DA和WA培養(yǎng)基上的最低。接種到PDA、HPDA和PA培養(yǎng)基上后，松材線蟲雌雄比接種早期逐漸增大，但隨著線蟲數(shù)量的逐漸增加，其雌雄比逐漸降低，而接種到DA和WA培養(yǎng)基后，松材線蟲雌雄比波動較小，且一直穩(wěn)定在1.0～1.5。松材線蟲雌雄比在PDA培養(yǎng)基上接種第3天時達(dá)到最大，在HPDA上的雌雄比第2天最高，而且在PDA上的最大值高于HPDA的最大值。以PDA培養(yǎng)基為對照，其他4種營養(yǎng)條件的培養(yǎng)基的雌雄比差異顯著(圖3)。

圖2 不同營養(yǎng)培養(yǎng)基上菌絲質(zhì)量Fig.2 The mass of mycelia on the different nutrition media*：平均值在0.05水平差異顯著The mean difference is significant at the 0.05 level.下同The same below.

2.3 α-蒎烯脅迫后松材線蟲雌雄比 高濃度α-蒎烯處理后，松材線蟲雌雄比分別在第2、4天出現(xiàn)2個峰值，第4天后逐漸降低最后穩(wěn)定在較低水平。低濃度處理后第2天時降低，隨后緩慢升高最后趨于穩(wěn)定?？偟膩碚f，高濃度α-蒎烯處理后雌雄比波動比較大，低濃度處理時波動較小。與對照組相比，高濃度和低濃度α-蒎烯處理差異顯著(圖4)。

2.4 β-蒎烯脅迫后松材線蟲雌雄比 根據(jù)圖5所示，接種前期，低濃度β-蒎烯比高濃度β-蒎烯處理后松材線蟲雌雄比高，但接種后第7天，高濃度β-蒎烯處理條件下的雌雄比高于低濃度β-蒎烯處理和對照組雌雄比?？傮w來說，低濃度與高濃度β-蒎烯處理后，松材線蟲雌雄比變化趨勢相同，松材線蟲雌雄比都是在第2天時降低隨后逐漸緩慢增加，且均穩(wěn)定在1.2～1.6。高濃度和低濃度β-蒎烯處理條件下沒有顯著差異，但與對照組相比，均有明顯差異。

2.5 α-蒎烯和β-蒎烯混合脅迫后松材線蟲雌雄比 如圖6所示，接種后第2天所有處理中松材線蟲雌雄比均降低，隨后緩慢增加且有輕微波動。與低濃度的α-蒎烯和β-蒎烯處理相比，α-蒎烯和β-蒎烯混合處理后松材線蟲雌雄比波動較小且一直穩(wěn)定在較低水平。在接種后期，低濃度α-蒎烯和β-蒎烯混合處理的松材線蟲雌雄比最低。與對照處理相比，接種前5天，α-蒎烯、β-蒎烯以及其混合處理后松材線蟲雌雄比存在顯著差異，第6天后差異不顯著。

圖4 α-蒎烯脅迫后松材線蟲雌雄比Fig.4 The sex ratio of PWN under the α-pinene stress

圖5 β-蒎烯脅迫后松材線蟲雌雄比Fig.5 The sex ratio of PWN under the β-pinene stress

圖6 α-蒎烯和β-蒎烯混合脅迫后松材線蟲雌雄比Fig.6 The sex ratio of PWN under the mixture of α-pinene and β-pinene stress

3 討論

松材線蟲入侵后，在寄主樹脂道迅速繁殖和遷移，最終導(dǎo)致松樹萎蔫甚至是死亡(Futai, 1980; Jonesetal., 2008)。松樹是否萎蔫或死亡與線蟲的繁殖率和遷移率相關(guān)(Filipiak, 2015)。松材線蟲繁殖率與遷移率越高，其致病力越強(qiáng)(Wangetal., 2005; Odanietal., 1985)。雌雄比是線蟲繁殖率的決定性因素，雌雄比率越高，線蟲繁殖能力越強(qiáng)。

松材線蟲接種到PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基后，在第3天時雌雄比最高，在3左右，而松材線蟲雌雄比為3.4時，其繁殖能力最高(Liuetal., 2014)，這可能是因為，在接種第3天后，松材線蟲適應(yīng)了營養(yǎng)豐富的新環(huán)境，繁殖率較強(qiáng)且活性較高。因此，PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基上菌絲體營養(yǎng)豐富且適合松材線蟲生長繁殖。而松材線蟲接種第7天以后，雌雄比穩(wěn)定在1.2～1.5，這可能是因為隨著松材線蟲數(shù)量逐漸增加，其密度不斷增大，達(dá)到了該真菌平板的最大容納量，此時松材線蟲必須通過控制其雌雄比調(diào)整其繁殖率從而適應(yīng)環(huán)境的不斷變化。這個時期的松材線蟲種群數(shù)量較大，活性適中，且雌雄比穩(wěn)定。因此，本試驗選擇了第7天的PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基上的松材線蟲作為試驗線蟲。

松材線蟲在營養(yǎng)富足環(huán)境條件下其雌雄比較高，在營養(yǎng)貧乏或密度較高時，雌雄比較低，這可能是因為營養(yǎng)充足條件下，適合雌性線蟲繁殖，產(chǎn)生大量的雌性線蟲后代，導(dǎo)致雌雄比比較高且呈現(xiàn)上升趨勢。而在種群數(shù)量的急劇增加，食物驟然減少情況下，抑制了雌性線蟲的發(fā)育，雄性線蟲逐漸增多，雌雄比降低。因此，適宜條件將促進(jìn)雌性線蟲產(chǎn)生，而逆境脅迫時容易產(chǎn)生雄性后代。該現(xiàn)象在其他植物寄生性線蟲中也有研究，馬鈴薯根結(jié)線蟲(H.rostochiensis)在巨細(xì)胞較大的時候或者營養(yǎng)含量較高時也會容易產(chǎn)生雌性后代，同時隨著入侵后代逐漸增加，在營養(yǎng)缺乏或者巨細(xì)胞空間不夠條件下產(chǎn)生雄性后代(Trudgill, 1967)。根結(jié)線蟲(M.incognita)和爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)在寄主馬鈴薯(Solanumtuberosum)上濃度比較高時，雄性后代的比例也會增加(Davideetal., 1967)。

松材線蟲在不同雌雄比條件下采取不同交配對策，該對策符合狀態(tài)制約選擇理論，即在雌性比例較高時采用Y交配對策，此時種群交配效率高，繁殖速率快；而雄性比例較高時采用X交配對策，此時交配效率低，種群繁殖慢(劉寶軍，2014)。在所有不適合環(huán)境如低濃度α-蒎烯和β-蒎烯及兩者混合處理條件下，松材線蟲雌雄比較低其波動較小，此時松材線蟲采取X交配對策，其繁殖率較低，而在高濃度α-蒎烯環(huán)境條件下，松材線蟲采取Y對策，繁殖率較高。

松材線蟲入侵后，寄主在樹脂道產(chǎn)生大量的單萜和倍半萜，主要是α-蒎烯和β-蒎烯等(Kuroda, 1989)。松材線蟲接種5年生馬尾松后，松樹α-蒎烯和β-蒎烯存在2次積累，第1次積累是松樹響應(yīng)松材線蟲入侵的主動防御反應(yīng)，而第2次大量積累是松材線蟲大量繁殖后，干擾寄主次級代謝反應(yīng)，從而誘導(dǎo)寄主次級代謝紊亂，是松樹被動防御的結(jié)果(王璇等，2017)。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度α-蒎烯和β-蒎烯以及兩者混合處理條件下，松材線蟲雌雄比較低且變化較小，而高濃度的α-蒎烯處理條件下其雌雄比較高。由于偏雌性的線蟲群體更容易產(chǎn)生后代，因此松材線蟲在低濃度α-蒎烯和β-蒎烯處理條件下種群繁殖率降低，而高濃度條件下松材線蟲繁殖率增加。另外，松材線蟲入侵后，解毒相關(guān)的基因響應(yīng)萜烯脅迫而大量表達(dá)(Kikuchietal., 2011; Shinyaetal., 2013)，該類基因有利于消除萜烯類次級代謝產(chǎn)物對松材線蟲的毒害作用，提高線蟲抗性，從而有利于線蟲在樹體內(nèi)大量繁殖。因此，在與寄主互作過程中，松材線蟲通過調(diào)整種群雌雄比，調(diào)節(jié)種群繁殖率，適應(yīng)松樹體內(nèi)萜烯等次級代謝產(chǎn)物變化，同時通過解毒相關(guān)功能因子提高抗性，從而在樹體內(nèi)大量繁殖。

4 結(jié)論

松材線蟲在適宜環(huán)境條件下產(chǎn)生較多雌性后代，種群加速繁殖，提高種群數(shù)量； 而在不適宜環(huán)境條件下產(chǎn)生較多的雄性后代，此時種群繁殖慢，產(chǎn)生較少的個體，從而提高種群適應(yīng)性。因此，在不同環(huán)境條件下，松材線蟲具有不同繁殖對策，松材線蟲會通過改變種群雌雄比來調(diào)整種群繁殖率從而適應(yīng)環(huán)境的變化。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

ChangingPatternofSexRatioofPineWoodNematode(Bursaphelenchusxylophilus)underDifferentNutritionConditionsandPineneStress

Wang Xuan Li Yongxia Zhang Xingyao

(LaboratoryofForestPathogenIntegratedBiologyResearchInstituteofForestryNewTechnology,CAFBeijing100091;Co-InnooationCenterforSustainableForestryinSouthernChina,NanjingForestryUniversityNanjing210037)

S763.18

A

1001-7488(2017)08-0149-06

10.11707/j.1001-7488.20170817

2016-04-21;

2017-06-12。

浙江省省院合作林業(yè)科技項目(2014SY17)；國家自然科學(xué)基金項目“松材線蟲致病相關(guān)基因協(xié)調(diào)致病機(jī)理研究”(201601001-720)。

*理永霞為通訊作者。