竹花葉病毒福州分離物基因組序列分析及其侵染性克隆的構建*

閆文凱 林文武 楊文婷 杜雅馨 吳祖建 楊 靚

(福建農林大學植物病毒研究所 福建省植物病毒學重點實驗室 福州 350002)

竹花葉病毒福州分離物基因組序列分析及其侵染性克隆的構建*

閆文凱 林文武 楊文婷 杜雅馨 吳祖建 楊 靚

(福建農林大學植物病毒研究所 福建省植物病毒學重點實驗室 福州 350002)

【目的】 研究BaMV福州分離物BaMV-TMS1及其攜帶的衛星RNA(satBaMV)分離物satBaMV-TMS1的全基因組特征，明確其系統發育關系； 對BaMV進行cDNA侵染性克隆構建方法的改進，為其反向遺傳學體系的快速建立提供簡便的方法?！痉椒ā?根據已報道的BaMV和satBaMV全長序列保守區分別設計2對和1對擴增引物，從感染BaMV的竹葉中擴增、克隆獲得BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1的全長序列，并進行序列特征分析和系統發育樹構建。采用多片段無縫克隆方法將擴增得到的2個病毒DNA片段和載體進行連接并轉化農桿菌，接種本氏煙后檢驗其侵染性?！窘Y果】 測序獲得的BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分離物核苷酸序列全長分別為6 366和834 nt(不含3′端的多聚腺苷酸尾)，具有典型的BaMV和satBaMV基因組結構特征。BaMV-TMS1分離物與已報道的其他分離物序列同源性為82%～83%，而satBaMV-TMS1分離物與其他分離物的序列同源性為92%～93%。系統進化樹分析表明，BaMV-TMS1分離物可單獨形成一簇，satBaMV-TMS1分離物也單獨形成一個新的分支。侵染性克隆通過農桿菌注射接種本氏煙10天以后，RT-PCR檢測以及透射電鏡負染觀察結果都驗證病毒成功侵染。【結論】 BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分離物與已知序列有著較高的變異度且生成新的系統發育樹分支，體現了該病毒與衛星RNA較高的遺傳多樣性。本研究成功構建具有生物活性的BaMV侵染性克隆且構建方法相對簡單快速。

竹花葉病毒； 衛星RNA； 全基因組； 系統發育； 侵染性克隆

Abstract： 【Objective】 Bamboo mosaic virus(BaMV), a typical member of the genusPotexvirus, is widespread in bamboo cultivation region and can severely affect regular growth of bamboos. Theobjective of this study is to determine the genomic structure of a new isolate of BaMV (BaMV-TMS1) and its associated satellite RNA(satBaMV-TMS1) from Fuzhou of China and their phylogenetic relationship with reported BaMV and satBaMV strains. Moreover, it is necessary to optimize an efficientmethod of constructing BaMV cDNA infectious clone for rapid establishment of reverse genetic system.【Method】 The complete genomes of BaMV-TMS1 and satBaMV-TMS1 were amplified and sequenced from bamboo leaves with mosaic symptom by respectively using 2 and 1 primer pairs designed according to the conserved regions of known sequences. Genomic structure was analyzed and phylogenetic tree was reconstructed by maximum likelihood (ML)method. Meanwhile, seamless cloningmethod of multiple segments was applied to ligate two segments of BaMV-TMS1 and an amplified vector segment. An agrobacteria-mediatedmethod was used to verify the infectivity of BaMV cDNA infectious clone.【Result】 The complete sequences of BaMV-TMS1 and satBaMV-TMS1 have 6365 and 836 nucleotides, respectively, excluding the 3′-terminal poly(A) tail and contain the typical characteristic of genomic structure of BaMV and satBaMV. The isolate BaMV-TMS1 shared the highest nucleotide sequence identity of 82%-83% and 92%-93%, respectively, with all the BaMV and satBaMV isolates available in GenBank. Phylogenetic analysis indicated that BaMV-TMS1 was clustered into a new phylogenetic sub-lineage. Similarresult can be seen that satBaMV-TMS1 was grouped into a new sub-cluster. Theresult of RT-PCR detection and negative staining of plant crude extraction showed the successful and highly-efficient infection of BaMV after 10 days post-inoculation.【Conclusion】 The isolates BaMV-TMS1 and satBaMV-TMS1 have a higher degree of variation and were clustered into a new phylogenetic sub-lineage considering all isolates analyzed in this study, suggesting a relatively higher genetic diversity of the virus and its associated satellite RNA. On the other hand, the study provides a rapid and efficientmethod of constructing BaMV cDNA infectious clone with biological activity.

Keywords： bamboo mosaic virus； satellite RNA； complete genome； phylogeny； cDNA infectious clone

竹亞科(Bambusoideae)屬單子葉禾本科(Gramineae)植物，全世界有70多屬1 200多種，主要分布于低緯度的熱帶或亞熱帶季風氣候區。我國是其世界分布中心之一，是世界上竹類資源最豐富、竹林面積最大、產量最高的國家，全國竹類植物有500多種。然而在竹類栽培過程中，竹子花葉病毒(bamboo mosaic virus, BaMV)的發生和流行威脅著竹類的生存且可能帶來嚴重的經濟損失(Linetal.,2016)。BaMV可使葉片花葉、竹筍和竹桿內部呈褐色條紋病變，造成竹筍木質化、發筍率降低、竹桿節間變短，進而影響竹材的經濟價值(Linetal.,1979； Yehetal.,1992)。BaMV最早在巴西泰山竹(Bambusavulgaris)和孝順竹(Bambusamultiples)上被發現，后來相繼在中國臺灣、美國加利福尼亞和佛羅里達以及中國福建等地的不同竹種中被發現，分布范圍以及寄主相當廣泛(Elliottetal.,1996; Linetal., 2016)。

在電子顯微鏡下BaMV為長490～510 nm的彎曲線形(Linetal., 1977)，其基因組為正單鏈RNA分子(Linetal., 1992)，全長6 366 bp左右，不計poly(A)，5′端帶有帽子結構，3′端帶有poly(A)尾巴，基因組結構包含5個開放閱讀框(open reading frame, ORF)。ORF1可編碼1個分子質量約為155 KDa的復制酶(replicase)。ORF2、3和4組成重疊三基因功能區(triple gene block, TGB)，其基因產物分別為TGBp1(28 KDa)、TGBp2(13 KDa)、TGBp3(6 KDa)，與病毒在寄主細胞間的運動有關，故又稱運動蛋白(Linetal., 2006; Wungetal., 1999； Juetal.,2007)。ORF5主要編碼25 KDa的外殼蛋白(coat protein，CP)，起包被核酸的作用(Linetal., 1992； 1994)。BaMV作為Potexvirus模式研究對象之一，其基因組結構和功能、與寄主植物互作途徑和機制以及作為表達載體的應用上都有了較為深入研究；然而，由于目前報道的BaMV全長序列較少，該病毒的遺傳多樣性研究至今還沒有較大進展。

以病毒侵染性克隆為基礎的反向遺傳學技術體系是現代分子病毒學研究中最基本、最重要的技術手段。對于BaMV侵染性克隆研究方面，Lin等(2004)構建了BaMV侵染性克??； Yang等(2007)將BaMV發展成為表達豬口蹄疫病毒抗原表位的疫苗載體； Liou等(2014)成功將BaMV以及satBaMV構建成為病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)載體用于本氏煙(Nicotianabenthamiana)的基因功能驗證。然而，這些侵染性克隆的構建方法過于繁瑣，且易受到酶切位點的限制。無縫克隆(scarless assembly)也稱為吉布森重組(Gibson assembly)的構建方法可以克服這些缺點，快速高效地將片段連接在載體上，目前還未見運用該方法構建BaMV侵染性克隆的研究報道。

本研究對麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)中的BaMV-TMS1以及satBaMV-TMS1分離物進行全基因組序列測定，并將BaMV-TMS1構建成侵染性克隆，為進一步研究BaMV和satBaMV的遺傳多樣性、基因功能、致病機制以及和寄主植物互作的途徑和機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

福州分離物BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1于2013年11月采自福州永泰天門山景區，呈典型花葉癥狀的麻竹上，前期經電鏡觀察及RT-PCR檢測等確定分別為BaMV和satBaMV分離物，新鮮樣品置于密封袋中，保存于-80 ℃超低溫冰箱。侵染性克隆載體pCAMBIATuMV:6K2-GFP、對照載體pCAMGFP、農桿菌(Agrobacterium)菌株GV3101由本實驗室保存。侵染性克隆載體pKB(Liouetal.， 2014)由臺灣中興大學生物科技學研究所徐堯輝老師惠贈。

1.2主要試劑

RNeasy Plant Mini Kit購自Qiagen公司； GoScriptTMReverse Transcription System購自Promega公司； TransStart KD Plus DNA Polymerase、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、DNA Marker、Trans1-T1感受態細胞均購自北京全式金公司(TransGen)； ClonExpressTMMultiS One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司(Vazyme)。

1.3試驗方法

1.3.1 RNA提取及基因克隆 根據RNeasy Plant Mini Kit提供的使用說明從感病的麻竹心葉中提取總RNA。由于BaMV和satBaMV在3’UTR末尾都帶有polyA，因此反轉錄過程中直接選用Oligo(dT)作為cDNA第一鏈合成的引物。本反應體系參照Promega公司GoScriptTMReverse Transcription System說明進行，獲得BaMV和satBaMV全長的cDNA。根據GenBank已報道的BaMV和satBaMV的全長序列分別設計2對和1對擴增引物(表1)，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

PCR擴增采用25 μL反應體系： 5×KD Plus buffer 5 μL，dNTPs(2.5mM)2 μL，正向引物和反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O 15.5 μL，KD Plus DNA Polymerase 0.5 μL，cDNA 1 μL。PCR反應條件為： 94 ℃預變性3 min； 94 ℃變性 30 s，復性30 s(退火溫度視基因片段而定)，68 ℃延伸若干分鐘(延伸時間按 1 min·kb-1計)，共34個循環； 最后一輪循環后68 ℃延伸10 min。PCR反應結束后，取產物5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產物經膠回收試劑盒純化后與pEASY-Blunt Zero克隆載體連接，并轉化到 Trans1-T1感受態細胞中。經菌落PCR鑒定篩選得到的陽性克隆子，每個片段各挑取5個委托南京金斯瑞生物技術有限公司測序，并通過測序峰圖及序列比對分析。

1.3.2 序列比對及組裝 測序獲得的多個克隆子序列使用DNAMAN 7.0軟件進行處理和拼接。序列一致性使用BLAST數據庫(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)在線比對。

1.3.3 系統發育分析 為分析BaMV以及satBaMV的系統發育關系，從GenBank中下載BaMV和satBaMV其他分離物的核苷酸序列作為參考，使用最大似然法(maximum likelihood，ML)基于BaMV和satBaMV全基因組的核苷酸序列構建系統發育樹。建樹前，使用MEGA5(Tamuraetal., 2011)的Muscle比對方法對建樹序列進行多重序列比對，利用Mrmodeltest選擇最優化的核苷酸替換模型，并按照AIC(akaike information criterion)標準設置相應參數，最后應用自舉法(bootstrap)評估各分支節點的自舉置信度(bootstrap confidence level)。

1.3.4 侵染性克隆載體構建 根據侵染性克隆載體pCAMBIATuMV:6K2-GFP的序列設計特異性反向擴增引物(表1)，對載體基體進行擴增(去除TuMV的序列)，可制備7 469 bp的線性化載體。由于載體片段較大，因此為減少由于PCR帶來的隨機突變，將PCR反應循環數降低到30左右。另外，為減少轉化過程中由于模板質粒而引進的假陽性率，使用高質量的試劑盒對線性化克隆載體進行膠回收純化，以提高DNA純度并去除一部分未線性化的環狀質粒。

為實現下一步重組反應，分別設計2對特異性引物pCAM1F/1R和pCAM2F/2R對陽性克隆菌液進行擴增(表1)。PCR反應體系應進行適當調整： 94 ℃預變性3 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸若干分鐘，共10個循環； 94 ℃變性30 s，65 ℃復性30 s，68 ℃延伸若干分鐘，共24個循環； 最后一輪循環后68 ℃延伸10 min。PCR反應預計分別擴增約3 527 bp和2 838 bp的目的片段。最后，根據ClonExpressTMMultiS One Step Cloning Kit的使用說明將載體和片段進行重組連接。

1.3.5 農桿菌侵染 pCAMBaMV-TMS1載體通過電擊轉化農桿菌感受態GV3101，含有載體的農桿菌培養后，經注射懸浮液(10 mmol·L-1MgCl2, 10 mmol·L-1MES, 200 μmol·L-1acetosyringone)室溫放置3 h后，用1 mL注射器將農桿菌注射到4周齡的本氏煙葉片，共注射3次，每次3株。注射后在溫室中培養(晝27 ℃/16 h； 夜22 ℃/8 h)，14天后觀察煙草發病情況。

1.3.6 RT-PCR檢測BaMV的侵染 對病毒侵染的本氏煙葉片提取總RNA，反轉錄獲得cDNA第一鏈，然過用特異性引物CpC-F/R進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.7 電鏡負染觀察BaMV病毒粒子 參照韋石泉等(1985)和Hitchborn等(1965)的方法對感病煙草中的病毒粒子進行電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分離物全基因組的擴增與序列分析

利用特異性引物，經PCR擴增獲得覆蓋BaMV和satBaMV基因組全長的3條特異性片段，電泳結果如圖1、2所示?？寺　y序、拼接后獲得BaMV-TMS1與satBaMV-MAZBZ基因組序列。BaMV-TMS1分離物全長6 366 nt(NCBI登錄號為KU936346)，satBaMV-TMS1分離物全長834 nt(NCBI登錄號為KU936347)，都分別具有典型的BaMV和satBaMV基因組結構特征，其基因的核苷酸和氨基酸序列與其他分離物的序列一致性比較如表2、3所示。

表1 引物Tab.1 Primers

圖1 BaMV-TMS1基因組全長的擴增產物Fig.1 The amplified products of full length gene of BaMV-TMS11、2和3、4分別為BaMV-TMS1基因組全長的2個片段； M.Trans15K DNA Marker; CK：陰性對照。1， 2 and 3,4 were the two separate amplified proolucts of full length gene of BaMV-TMS1;M:Trans15K DNA Marker;CK:negative control.

圖2 satBaMV-TMS1全長的擴增產物Fig.2 The amplified products of satBaMV-TMS15和6為satBaMV-TMS1全長的擴增產物； M：D2000 plus DNA ladder; CK：陰性對照。 5 and 6 were amplified products of full length； M:D2000 plus DNA ladder; CK:negative control.

2.2系統發育分析

根據Mrmodeltest軟件的AIC標準，建樹序列最適合的核苷酸替換模型為GTR+I+G。ML法重建的系統發育樹如圖3、4所示，BaMV-TMS1分離物可形成一個新的分支； 同樣，satBaMV-TMS1分離物也單獨形成一個新的分支，且與臺灣分離物具有明顯的地域性。

2.3BaMV-TMS1侵染性克隆的構建

利用設計的特異性引物，分別對載體和病毒片段進行PCR擴增，所獲得的片段均符合預期大小(圖5、6)。將上述PCR產物回收后，分別加入150 ng載體片段、70 ng病毒片段1和 57 ng病毒片段2于重組反應體系中進行反應。經挑取單菌落檢測全長片段(6 366 nt)，陽性率高達70%(圖7)。

表2 satBaMV的核苷酸和氨基酸序列與其他分離物一致性比較①Tab.2 Comparison of the nucleotide and amino sequences consistency between satBaMV and other isolates

①表中數字表示BaMV及satBaMV福州分離物與其他分離物氨基酸序列一致性的百分比(括號內為氨基酸一致性百分比),(-)表示非編碼區，不編碼氨基酸。下同。The numbers in table illustrates the percentage of sequences consistency of the genomic regions of the BaMV and satBaMV Fuzhou isolate (amino acids in parentheses) to other isolates for which complete genome sequences are avaliable. (-) meansnon-coding sequence without amino acid.The same below.

表3 BaMV的氨基序列和氨基酸與其他分離物一致性比較Tab.3 The comparison of the nucleotide and amino sequences consistency between BaMV and other isolates

圖3 BaMV-TMS1的系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of BaMV-TMS1

圖4 satBaMV-TMS1的系統發育樹Fig.4 The phylogenetic tree of satBaMV-TMS1

圖5 載體pCAMBIA的擴增Fig.5 The amplification of vector pCAMBIA1:陰性對照; 2～11: 載體擴增; M：Trans15K DNA Marker。 1: Negative control; 2-11: The amplification of vector; M:Trans15K DNA Marker.

圖6 BaMV基因的擴增Fig.6 The amplification of BaMV gene1和2、3和4分別為2個基因片段;M:Trans15K DNA Marker。 1 and 2、3 and 4: The two separate amplified target fragments； M:Trans15K DNA Marker.

圖7 BaMV-TMS1基因全長的檢測Fig.7 The detection of full genome sequences of BaMV-TMS11～10:單菌落；M:Trans15K DNA Marker。1-10: Single colony； M:Trans15K DNA Marker.

2.4對感病本氏煙進行RT-PCR檢測和電鏡負染觀察

將構建的pCAMBaMV-TMS1侵染性克隆導入農桿菌GV3101后，注射4周齡的本氏煙；同時，分別以導入pKB和pCAMGFP載體的農桿菌侵染煙草植株作為陽性和陰性對照。結果表明： 含有pKB載體的農桿菌接種本氏煙10天以后，上部系統葉片開始出現花葉癥狀，隨后病狀加重； 含有載體pCAMBaMV-TMS1的農桿菌侵染本氏煙20天后出現輕微的花葉癥狀； 而含有載體pCAMGFP的農桿菌侵染本氏煙后沒有出現任何癥狀(圖8)。分別提取3組本氏煙的總RNA，以BaMV外殼蛋白保守區設計的特異性檢測引物CpC-F/R(Linetal., 2016)(表1)進行RT-PCR擴增，結果表明，經含有侵染性克隆pCAMBaMV-TMS1和pKB的農桿菌侵染本氏煙后，PCR擴增都得到527 bp左右的特異性條帶，而陰性對照組則沒有擴增到相應條帶(圖9)。采用病葉榨汁登網并負染的方法，以pKB為對照，對病葉中的病毒進行電鏡負染觀察，結果顯示，在電鏡下觀察到許多桿狀、長度約為490～510 nm彎曲線形的病毒粒子(圖10)，是BaMV病毒粒子的形態特征。

圖8 BamV-TMS1侵染的本氏煙癥狀Fig.8 The Nicotiana benthamiana symptom of BaMV inoculation

圖9 RT-PCR檢測Fig.9 The detection of RT-PCR1:pCAMBaMV-TMS1; 2:陰性對照; 3:陽性對照;M:TIANGEN MarkerⅢ。1:pCAMBaMV-TMS1; 2: negative control; 3:positive control; M: MarkerⅢ of TIANGEN.

圖10 電鏡觀察病毒粒子Fig.10 The virus particle in electron microscope

3 討論

本研究從福州永泰天門山景區采得帶有重型花葉癥狀的麻竹樣品，根據GenBank中已知的BaMV和satBaMV不同分離物序列設計特異性的擴增引物，利用RT-PCR擴增和測序成功獲得BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分離物的全基因組序列。經NCBI BLAST比對顯示，BaMV-TMS1分離物與已報道的序列一致性為82%～83%，而satBaMV-TMS1與其他分離物的序列一致性為92%～93%。系統進化樹分析表明，BaMV-TMS1分離物并沒有與已知的福州分離物聚在一起，而是與臺灣分離物親緣關系較為接近，且同時形成一個新的分支。這可能與臺灣與大陸地區竹類品種往來運輸有關，但該病毒具體的起源地在何處，還需要進行更多的研究。同樣，satBaMV-TMS1分離物在系統發育分析中也形成一個單獨的分支，該結果表明BaMV和satBaMV在自然界中受到較大的選擇壓力影響，序列變異度較大，存在較高的遺傳多樣性，但其基因組結構及其編碼的功能蛋白沒有受到影響。

隨著RNA病毒的cDNA侵染性克隆技術的發展，可在DNA水平上對RNA病毒進行有目的性的改造，這為研究RNA病毒與寄主的相互作用機制提供了很好的手段。植物病毒侵染性克隆首先在雀麥花葉病毒中獲得成功(Ahlquistetal.,1984), 至今已有多種植物病毒成功地構建了全長cDNA侵染性克隆。然而，傳統的cDNA侵染性克隆的構建方法步驟相對繁瑣、操作不易且成功率低，為避免由于長片段擴增而帶來的隨機突變，常通過短片段的擴增，經過限制性酶切位點的切割和連接將片段和載體重新連接而成。但是，這種方法往往會受到酶切位點的限制，且會引入一些非病毒序列的片段影響病毒的轉錄起始和終止，從而導致喪失病毒侵染性(Chiangetal., 1997)。無縫克隆技術是由Gibson等(2009)首次提出的，可實現多個DNA片段同時無縫接合到1個載體上。目前，該技術已成功運用于多種RNA病毒的基因組重構和侵染性克隆構建，如流感病毒A(influenza A virus)(Zhouetal., 2009)、登革熱病毒(dengue virus)(Siridechadiloketal., 2013)、西尼羅病毒(West Nile virus)(Vandergaastetal., 2014)、豬繁殖和呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)(Suhardimanetal., 2015)、萵苣花葉病毒(Lettuce mosaic virus)(Bordatetal., 2015)等。目前還沒有報道使用該方法對BaMV進行侵染性克隆的構建。本研究中，根據已知的病毒和載體序列，分別設計引物進行PCR擴增； 回收產物經純化后按照一定比例加入連接體系，PCR檢測陽性率高達70%。該方法采用農桿菌瞬時表達法轉錄病毒基因組侵染植物，無需體外轉錄，操作方便快速，不需要昂貴的試劑，并且接種效率高達100%，適合大規模的遺傳操作。因此，BaMV侵染性克隆快速構建方法的成功建立，將為下一步研究不同BaMV分離物的侵染性、發展運用于驗證竹類植物內源基因功能的VIGS載體以及研究抗病毒策略等科學問題提供有力的技術手段。

4 結論

通過分析大陸和臺灣BaMV及satBaMV分離物的全基因組序列，發現BaMV及satBaMV具有較高的遺傳多樣性，系統進化樹分析也得到相似的結果。另外，本試驗成功快速構建了大陸BaMV-TMS1分離物的侵染性克隆，接種本氏煙后有明顯的花葉癥狀，并通過RT-PCR檢測和電鏡負染的方法驗證了其侵染性。

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(責任編輯 王艷娜)

CompleteGenomeSequenceAnalysisandInfectiousCloneConstructionofBambooMosaicVirusIsolatedfromFuzhou

Yan Wenkai Lin Wenwu Yang Wenting Du Yaxin Wu Zujian Yang Liang

(KeyLaboratoryofPlantVirologyofFujianProvinceInstituteofPlantVirology,FujianAgricultureandForestryUniversityFuzhou350002)

S763.11

A

1001-7488(2017)08-0035-08

10.11707/j.1001-7488.20170805

2016-06-12；

2016-07-30。

教育部博士點基金項目(20113515110001)； 福建省自然科學基金項目(2014J06011)； 福建省高校杰出青年科研人才培育計劃(JA13092)； “福建農林大學杰出青年科研人才”培養專項基金項目(xjq201402)。

*楊靚為通訊作者。