耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌耐藥機制及治療策略研究*

向 丹，張利軍，周先玉，王云英

(重慶醫科大學附屬第二醫院檢驗科，重慶 400010)

論著·臨床研究

耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌耐藥機制及治療策略研究*

向 丹，張利軍，周先玉，王云英△

(重慶醫科大學附屬第二醫院檢驗科，重慶 400010)

目的探索耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌耐藥機制及治療對策。方法收集來自該院的17株耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌臨床資料，采用PCR方法擴增碳青霉烯類耐藥基因；采用瓊脂稀釋法和肉湯稀釋棋盤法測磷霉素單藥及聯合用藥最低抑菌濃度(MIC)值，計算部分抑菌濃度指數(ΣFICI)。結果8株菌產blaNDM-1，9株菌產blaIMP，blaKPC、blaOXA-48、blaSPM均未檢出；磷霉素聯合亞胺培南協同作用和相加作用占75.00%，其中協同作用高達56.25%，磷霉素聯合頭孢哌酮/舒巴坦鈉協同作用和相加作用占50.00%。結論磷霉素聯合亞胺培南或頭孢哌酮/舒巴坦鈉體外有較好的抗菌活性，亞胺培南聯合磷霉素效果可能更好。

β內酰胺酶類；碳；檸檬酸桿菌，弗氏；碳青霉烯酶；弗勞地枸櫞酸桿菌；聯合藥敏；耐藥機制

弗勞地枸櫞酸桿菌為條件致病菌，當機體抵抗力下降時，可引起呼吸道、消化道、泌尿系統感染及敗血癥等[1]。隨著臨床碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，耐碳青霉烯類菌株的臨床檢出率逐年增加，多呈廣泛耐藥(XDR)或全耐藥(PDR)的特征[2-4]。臨床醫生對多重耐藥菌感染的治療常感到棘手，探索針對此類細菌感染的新的治療策略迫在眉睫[3]。本研究對耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌耐藥情況及耐藥機制進行分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 收集本院2013年3月至2016年1月從臨床標本中分離的17株亞胺培南耐藥的弗勞地枸櫞酸桿菌，采用改良Hodge試驗和乙二胺四乙酸(EDTA)紙片增效法篩查試驗菌株耐藥表型。所有菌株均用VITEK 2-Compact全自動微生物分析系統進行細菌鑒定和藥敏試驗，結果按照2015版美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)規則和標準[5]判定。質控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922，銅綠假單胞ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 35218，肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 哥倫比亞血平板、巧克力平板、麥康凱平板、血培養瓶、藥敏M-H平板(法國生物梅里埃公司)，藥敏紙片(英國Oxoid公司)，磷霉素(山西仟源醫藥集團股份有限公司)，亞胺培南(美國默沙東公司)，頭孢哌酮/舒巴坦鈉(SCF，美國輝瑞制藥有限公司)，6-磷酸葡萄糖(德國Sigma公司)；血培養儀Bact/Alert 3D、自動化鑒定儀VITEK2-Compact(法國生物梅里埃公司)，PCR儀、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，PCR相關試劑(大連Takara生物有限公司)。

1.2.2碳青霉烯類耐藥基因檢測 采用PCR檢測菌株耐藥基因，煮沸法提取細菌DNA，反應體系：總反應體積 25.00 μL，DNA 2.00 μL，引物各0.75 μL，Takara rTaq DNA polymerase 12.50 μL，滅菌純水 9.00 μL；反應條件：95 ℃ 預變性 5 min，95 ℃ 變性30 s，退火溫度55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環，72 ℃延伸10 min，引物序列[4]及來源見表1。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖(含goodview)電泳分離，凝膠成像系統成像觀察結果。PCR擴增產物送由上海生工生物工程股份有限公司合成測序，測序結果在NCBI上使用BLAST程序比對(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

表1 耐藥基因擴增引物序列

F：上游序列；R：下游序列

1.2.3磷霉素單藥及聯合用藥最低抑菌濃度(MIC)值檢測

1.2.3.1瓊脂稀釋法測單藥MIC值 磷霉素(在配制磷霉素的M-H瓊脂時加入一定量的6-磷酸葡萄糖，使其最終濃度為25 μg/mL)、亞胺培南、SCF單藥藥敏試驗采用瓊脂稀釋法檢測，藥物最低濃度無細菌生長者，即為該藥物對受試菌的MIC值。

1.2.3.2肉湯稀釋棋盤法測磷霉素聯合用藥MIC值 根據瓊脂稀釋法測定MIC值確定藥物聯合測定的稀釋度，以MIC值為中間點。使用96孔無菌微孔板，將配置好的每種抗菌藥物最高從4倍MIC濃度開始用無菌M-H肉湯倍比稀釋，取7個稀釋濃度，各取60 μL分別排列在微孔板的行與列上，然后在無菌微孔板上加入120 μL配置好的菌液，使最終接種菌量為5×105CFU/mL，混勻，37 ℃過夜孵育培養，無菌生長的最低濃度為對應的MIC值。通過FIC指數計算公式，判斷聯合效果部分抑菌指數(∑FICI)，計算和判讀標準:∑FICI=聯合時甲藥的MIC/甲藥的MIC+聯合時乙藥的MIC/乙藥的MIC。∑FICI≤0.5為協同作用，>0.5～<1.0為相加作用，≥1.0～<2.0為無關作用，≥2.0為拮抗作用[6]。

1.3統計學處理 主要采用統計學描述。

2 結 果

2.1菌株臨床資料 17株耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌菌株臨床資料統計見表2。

2.2耐藥表型及耐藥基因檢測結果 改良Hodge試驗和EDTA紙片增效法篩查結果：17株菌均顯示陽性，檢出率為100%(17/17)。采用PCR方法對17株菌耐藥基因進行檢測，其中8株菌產blaNDM-1，檢出率為47.06%(8/17)；9株菌產blaIMP，檢出率為52.94%(9/17)；blaKPC、blaOXA-48、blaSPM均未檢出，見圖1。

2.3菌株耐藥情況分析 藥敏結果按照2015版CLSI規則和標準[5]進行判定。其中菌株對哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、阿米卡星體外有較高的敏感度，敏感率分別是58.82%、52.94%、47.06%；對妥布霉素、頭孢吡肟體外敏感度較差，敏感率均為23.53%；對頭孢他啶、環丙沙星、復方磺胺甲噁唑、頭孢噻肟則表現為全部耐藥，見表3。

表2 17株菌株臨床資料統計

圖1 blaNDM-1耐藥基因擴增電泳圖

抗菌藥物耐藥數(n)耐藥率(%)敏感數(n)敏感率(%)哌拉西林/他唑巴坦741.181058.82氨曲南847.06952.94妥布霉素1376.47423.53阿米卡星952.94847.06頭孢他啶17100.0000環丙沙星17100.0000復方磺胺甲噁唑17100.0000頭孢克肟1694.1200頭孢吡肟529.41423.53慶大霉素1694.1215.88左氧氟沙星952.9415.88頭孢噻肟17100.0000

2.4瓊脂稀釋法和肉湯稀釋棋盤法測磷霉素單藥及聯合用藥的MIC值 磷霉素與亞胺培南、SCF單用及聯合用藥的MIC結果見表4。磷霉素與亞胺培南聯用，ΣFICI≤0.5占56.25%，>0.5～<1.0占18.75%，≥1.0～<2.0占25.00%；磷霉素與SCF聯用，ΣFIC≤0.5占12.50%，>0.5～<1.0占37.50%，≥1.0～<2.0占50.00%，見表5。

表4 磷霉素與亞胺培南、SCF單藥與聯用的體外抗菌活性

表5 FICI指數分布百分比(%)

3 討 論

碳青霉烯類抗菌藥物被認為是治療革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線，有報道指出腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的敏感度逐年下降[1,7]，且隨著臨床多重耐藥菌的檢出逐年增加[3,8]，新的抗菌藥物研發過程緩慢，使耐碳青霉烯類細菌感染的治療變得更加困難。因此，研究這些耐藥菌的耐藥機制和尋找更有效的治療方法尤為重要。

本研究中，試驗菌株分部在不同的科室，菌株標本主要來自血液和靜脈導管，和弗勞地枸櫞酸桿菌主要引起呼吸系統、尿道系統感染結論不一致[7]，提示耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌感染的多樣性，可引起多部位的感染。同一科室同一時期或不同時期多次檢出該菌株，不排除該菌株長期持續存在于環境中或是菌株來自同一菌屬的可能，本課題組將進一步對菌株的流行病學進行研究。

在中國有報道指出產blaNDM-1的菌株主要是鮑曼不動桿菌[9]，而國外則認為肺炎克雷伯菌是主要產blaNDM-1的菌株[10]。本研究采用PCR方法對菌株耐藥基因進行檢測，17株菌株均產金屬β-內酰胺酶，其中8株產blaNDM-1，9株產blaIMP，不同于其他研究[9-10]，同時，本研究中所有菌株均產金屬β-內酰胺酶，金屬β-內酰胺酶能有效水解除氨曲南以外的幾乎所有β-內酰胺類抗菌藥物，表3顯示氨曲南耐藥率為47.06%，提示菌株在產碳青霉烯酶的同時可能合并其他耐藥機制。

17株菌對2、3代頭孢菌素和磺胺類抗菌藥物耐藥率達到100.00%，喹諾酮類耐藥率高達90.00%以上，治療時應該首先避免選用此類抗菌藥物；氨基糖苷類抗菌藥物中阿米卡星敏感率47.06%，較其他氨基糖苷類抗菌藥物敏感率高，這和其他研究一致[11]，但由于氨基糖苷類抗菌藥物毒副作用大，不建議首選治療。哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南敏感率較高，但對XDR腸桿科細菌感染診療的專家共識并不建議單獨用藥。目前，國外有研究指出磷霉素單用或聯合使用其他藥物，對于治療耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌療效顯著[12-13]。磷霉素屬于細菌繁殖期快速殺菌劑，抗菌譜廣，對革蘭陽性菌及革蘭陰性菌均有殺滅作用，通過抑制細菌細胞壁的早期合成，破壞其完整性，有利于其他抗菌藥物進入細菌體內，從而殺滅細菌[14]。本研究采用肉湯稀釋棋盤法對磷霉素、磷霉素+亞胺培南、磷霉素+SCF體外抗菌活性進行研究，結果顯示：聯合用藥較單一用藥時的MIC50、MIC90明顯降低，磷霉素聯合亞胺培南協同作用和相加作用占75.00%，其中協同作用高達56.25%，明顯高于國內其他研究[15]，磷霉素聯合SCF協同作用和相加作用占50.00%，低于磷霉素聯合亞胺培南。故治療耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌的感染時，可以考慮使用亞胺培南或SCF+磷霉素治療，根據體外藥敏試驗結果亞胺培南+磷霉素可能效果更佳。

綜上所述，本研究用磷霉素聯合亞胺培南或SCF對耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌進行了體外藥物敏感試驗，試驗結果顯示磷霉素聯合亞胺培南或SCF在體外均有較好的抗菌活性，特別是亞胺培南+磷霉素可能效果更好。在新型抗菌藥物有限的前提下，磷霉素聯合其他抗菌藥物治療耐藥菌感染可能是臨床抗感染治療的一個新方向，但需要指出的是，到目前為止臨床使用磷霉素聯合其他抗菌藥物抗感染治療仍然缺乏臨床研究，臨床用藥需謹慎。

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Studyondrugresistancemechanismincarbapenem-resistantCitrobacterfreundiiandtreatmentstrategies*

XiangDan，ZhangLijun，ZhouXianyu，WangYunying△

(DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

ObjectiveTo explore the drug resistance mechanisms of carbapenem-resistant Citrobacter freundii (C.freundii) and its treatment strategies.MethodsClinical data of 17 strains of carbapenem-resistant C.freundii from this hospital were collected.Carbapenemase resistant genes were amplifies by polymerase chain reaction (PCR).The agar dilution method and the broth dilution method were used to determine the minimal inhibition concentration (MIC) of single antimicrobial drug and drug combination,the partial inhibitory concentration index (∑FICI) was calculated.ResultsEight strains were found to produce blaNDM-1and 9 strains produced blaIMP,blaKPC,blaSPMand blaOXA-48were not detected in the study.Furthermore,the synergistic effect and addictive effect of fosfomycin combined imipenem accounted for 75.00%,in which,the synergistic effect was up to 56.25%.the synergistic effect and addictive effect of fosfomycin and cefoperazone/sulbactam accounted for 50.00%.ConclusionFosfomycin combined with imipenem or cefoperazone/sulbactam has good antibacterial activity in vitro,but imipenem combined with fosfomycin may have better effect.

beta-lactamases；carbon;citrobacter,freundii；carbapenemase;Citerobacter freundii (C.freundii);combined chemosensitivity;resistance mechanisms

R446.5

A

1671-8348(2017)26-3635-03

2017-02-24

2017-06-21)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.012

重慶市科委基礎科學與前沿技術研究(一般)項目(cstc2017jcyjAX0065)。

向丹(1990-)，初級技師，在讀碩士，主要從事臨床微生物方面研究。△

，E-mail:yuzhihang1118@sina.com。