補腎活血排毒法組方中藥對慢性腎臟病大鼠腎臟細胞凋亡的影響*

黎 穎，唐 佳，熊維建，宋 娜，賴宗浪，周 鑫，鐘 錦△

(重慶市中醫院：1.腎病科；2.腫瘤科；3.內分泌科 400021)

論著·基礎研究

補腎活血排毒法組方中藥對慢性腎臟病大鼠腎臟細胞凋亡的影響*

黎 穎1，唐 佳1，熊維建1，宋 娜2，賴宗浪2，周 鑫3，鐘 錦1△

(重慶市中醫院：1.腎病科；2.腫瘤科；3.內分泌科 400021)

目的觀察補腎活血排毒法組方中藥對慢性腎臟病大鼠的治療作用及細胞凋亡的影響。方法采用單側輸尿管梗阻(UUO)動物模型，將SD雄性大鼠分為假手術組、UUO模型組、補腎活血排毒法中藥低劑量治療組和高劑量治療組，自動生化分析儀檢測腎功能；蘇木素-伊紅(HE)染色檢測腎臟組織病理損傷；TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡；Western blot法檢測B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)水平。結果與UUO模型組相比，補腎活血排毒法中藥各劑量組血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)均明顯下降(P<0.05)。病理觀察，模型組可見腎小管上皮細胞凋亡、壞死、脫落，炎性細胞浸潤，補腎活血排毒法中藥各劑量組均較UUO模型組腎損傷程度輕(P<0.05)。TUNEL法檢測UUO模型組細胞凋亡數較假手術組明顯增多，補腎活血排毒法中藥各劑量組可顯著減少細胞凋亡數目(P<0.05)。與UUO模型組相較，補腎活血排毒法中藥各劑量治療組Bcl-2水平明顯上調，Bax 水平下調，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。以上結果均呈劑量依賴性。結論補腎活血排毒法中藥能明顯下調血清肌酐和尿素氮水平，抑制UUO大鼠腎臟細胞凋亡，調節Bcl-2、Bax水平。

慢性腎臟?。恢兴幆煼?；細胞凋亡；補腎活血排毒法組方中藥；Bcl-2/Bax

慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)是由各種原因造成的腎單位嚴重受損，腎小球濾過率進行性下降，機體排泄代謝廢物和調節水電解質、酸堿平衡紊亂的臨床綜合征[1]?，F代醫學對CKD的有效治療主要為血液透析和腎移植等，但其均不能用于治療早中期CKD，且費用昂貴，已成為患者家庭的沉重負擔。因此，如何延緩CKD病程的進展，已成為醫學界面臨的重大課程。補腎活血排毒法組方中藥是本院國醫大師鄭新教授治療CKD患者的經驗方，在多年臨床治療中取得滿意療效。為進一步探討其作用機制，本實驗觀察補腎活血排毒法組方中藥對單側輸尿管梗阻(UUO)所致CKD大鼠腎臟細胞凋亡的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物選用健康SD雄性大鼠，5～7周齡，體質量220～280 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。補腎活血排毒法組方中藥：黃芪、紅參、大黃、淫羊藿、川芎、杜仲等，均購自重慶市中醫院中藥房，經煎煮、過濾、水浴蒸發分別濃縮至2.0 g·kg-1·d-1和4.0 g·kg-1·d-1，置于冰箱保存。主要試劑為TUNEL檢測細胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司，兔抗大鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

表1 治療前與治療后各組BUN、Scr變化比較

a：P<0.05,與假手術組比較；b：P<0.05,與UUO模型組比較；c:P<0.05，與治療前比較；d:P<0.05，與低劑量組比較

1.2方法

1.2.1動物模型的建立與分組 UUO動物模型的建立：大鼠經10%水合氯醛麻醉后，采用左側背部切開腹腔，鈍性分離左側輸尿管，于輸尿管中上1/3 處以4-0線雙重結扎后切斷輸尿管，分層縫合關閉腹腔。48只大鼠分4組：(1)假手術組；(2)UUO模型組；(3)補腎活血排毒法中藥低劑量組(簡稱低劑量組)；(4)補腎活血排毒法中藥高劑量組(簡稱高劑量組)。假手術組只找到輸尿管，不結扎，常規喂養。各組大鼠分別于術后第14天時分批(12只)處死，留取大鼠血液標本及左側腎臟。

1.2.2給藥方法 于手術后第1天開始灌胃給藥治療，補腎活血排毒法組方中藥治療組分別予高劑量(4.0 g·kg-1·d-1)和低劑量(2.0 g·kg-1·d-1)灌胃，UUO模型組予等量0.9%生理鹽水，每天1次,連續14 d,實驗過程中大鼠自由進食、飲水，室溫控制在20～24 ℃，通風濕度良好。

1.2.3生化分析儀檢測腎功能 治療前取尾靜脈血，治療后斷頭取血，采血前禁食8 h。血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)用生化分析儀測定。

1.2.4組織病理學檢查 取經4%多聚甲醛溶液固定24 h的腎臟組織標本，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4 μm的石蠟切片，按常規方法進行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.5Western blot法檢測目的蛋白 Western blot分析腎臟組織Bcl-2、Bax的表達。用總蛋白裂解液提取腎臟總蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白質濃度，每泳道上樣40 μg 蛋白，電泳、轉膜后，5%牛血清清蛋白TBST溶液室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后再以辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育；洗膜，加電化學發光(ECL)發光液，Fujifilm化學發光成像系統拍照。Image Pro Plus 6.0 分析各條帶的累積光密度值，將各目的條帶與同一泳道內參照β-actin 的累積光密度值的比值作為該泳道中目的蛋白表達的半定量結果。

1.2.6TUNEL法檢測細胞凋亡 石蠟切片厚4 μm，常規脫蠟入水。3%H2O2室溫處理10 min,加1∶100 TBS新鮮稀釋的蛋白酶K 37 ℃消化10 min。洗滌后加脫氧核苷酸末端轉移酶(TdT)和地高辛標記的脫氧核苷(Dig-dUTP),置濕盒中4 ℃過夜。洗滌，加封閉液室溫30 min，加1∶100封閉液稀釋的生物素化抗地高辛抗體，37 ℃ 30 min，加鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)試劑盒37 ℃ 30 min，充分水洗后二氨基聯苯胺(DAB)顯色，光鏡觀察。

2 結 果

2.1各組大鼠腎功能比較 UUO模型組大鼠的BUN、Scr在術后明顯上升(P<0.05)；術后，高劑量組和低劑量組的BUN和Scr較UUO模型組明顯下降(P<0.05)，其中高劑量組組較低劑量治療組腎功能改善更明顯(P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠腎臟病變比較 HE染色顯示，光鏡下假手術組大鼠腎小管基底膜完整，小管上皮細胞結構清晰，未見變性壞死，腔內未見管型。UUO模型組大鼠在皮質區及外髓質區可以見到典型的腎小管壞死，包括腎小管上皮細胞凋亡(RTECs)嚴重變性、崩解和脫落，腎小管管腔擴張，腎間質水腫及炎癥細胞浸潤。而高、低劑量組的腎組織損傷程度較UUO模型組有所減輕，高劑量組較低劑量組病理改善更明顯。半定量評分顯示高、低劑量組的腎損傷程度明顯低于UUO模型組(P<0.05)，高劑量組較低劑量組腎損傷程度輕(P<0.05)，見圖1。

A:假手術組;B:UUO模型組;C:低劑量組;D：高劑量組；E：半定量分析圖

圖1各組大鼠腎臟病變比較(HE，×400)

2.3各組大鼠腎臟凋亡比較 假手術組腎組織中僅見到極其少量的TUNEL陽性細胞；UUO模型組大鼠見到大量TUNEL陽性細胞，主要分布在腎臟的皮質區和外髓質區；高、低劑量組的TUNEL細胞凋亡數均較UUO模型組減少，高劑量組的TUNEL細胞凋亡數較低劑量組明顯減少(P<0.05)，見圖2。

2.4各組大鼠腎臟Bcl-2、Bax水平比較 UUO模型組腎組織中Bcl-2、Bax水平較假手術組明顯升高，但Bcl-2/Bax比值下降。高、低劑量組腎臟Bcl-2水平較UUO模型組明顯升高，但Bax水平明顯下降，Bcl-2/Bax比值高于假手術組和UUO模型組(P<0.05)，高劑量組Bcl/Bax比值較低劑量組更高(P<0.05)，見圖3。

A:假手術組;B:UUO模型組;C:低劑量組;D：高劑量組;E:定量分析圖

圖2各組慢性腎衰竭大鼠腎臟凋亡比較(TUNEL,×400)

A:大鼠腎臟組織Bcl-2蛋白水平比較;B:大鼠腎臟組織Bax蛋白水平比較;C：Bcl-2/Bax比值強度比較

圖3各組Bcl-2和Bax水平比較

3 討 論

CKD屬于中醫“水腫”“溺毒”“關格”“虛勞”等范疇。祖國醫學認識CKD病因病機多為臟腑虛損，又因外邪侵襲，情志所傷，勞累過度而使病情加重，最后導致正虛邪實[2-3]。本院國醫大師鄭新教授認為正虛與濁毒、久病而瘀是本病的中心環節，其研制的以扶正祛邪法為大法的補腎活血排毒法組方中藥，具有補腎活血、排毒降濁的功效，可改善腎虛血瘀的病理變化，使機體陰陽平衡，扶正祛邪[4]。本課題組前期臨床研究發現，補腎活血排毒法組方中藥可顯著降低患者血中SCr、BUN的水平，以改善CKD患者脘腹脹滿、食少納呆、惡心嘔吐、大便秘結不通等癥狀，延緩CKD患者的病程進展[5]，但其具體作用機制，尚不清楚。

現代醫學研究證實RTECs是CKD重要的發病機制之一[6-8]。CKD患者腎臟局部炎癥因子過度表達，腎素-血管緊張系統(RAS)激活，氧化應激反應等導致RTECs線粒體損傷，線粒體膜通透性改變，凋亡蛋白包括細胞色素-C(Cyt-C)、激活胱天蛋白酶(Caspase)蛋白酶、細胞凋亡誘導因子(AIF)等從線粒體到胞質，導致RTECs凋亡[9-11]。因此，抑制RTECs的凋亡，改善腎小管間質的損傷，是延緩CKD進展的重要干預環節。在本實驗研究發現，單側切斷大鼠輸尿管14 d，存在著腎小管間質明顯損傷、RTECs凋亡，并且與腎小管壞死甚至結構消失相平行。RTECs大鼠經補腎活血排毒法中藥治療后，RTECs凋亡明顯減少，腎臟病理損害和功能異常明顯得到改善，提示可以通過補腎活血排毒法組法中藥治療抑制RTECs凋亡而發揮腎臟保護作用。

大量研究進一步證實線粒體/Cyt-C信號通路是激活 Caspase執行細胞凋亡的重要途徑。Bcl-2家族對該途徑有重要的調控作用，其中Bcl-2/Bax比率調控著線粒體膜是否受損及細胞是否發生凋亡。線粒體膜受損后釋放Cyt-C，Cyt-C與細胞凋亡因子Apaf1形成復合物激活Caspase-9，進而級聯激活Caspase-3，導致細胞凋亡[12-13]。大鼠造模14 d后，Bcl-2與Bax的表達均明顯升高，但Bax升高更明顯，故Bcl-2/Bax比值降低，細胞凋亡增加，這與其他學者的研究報道相一致[14-15]；給予UUO大鼠補腎活血排毒法組方中藥治療后，Bcl-2、Bcl/Bax水平明顯升高，而Bax的表達則明顯下降，并呈劑量依賴，提示補腎活血排毒法中藥可能通過促進Bcl-2的表達、抑制Bax的表達，發揮抗凋亡作用。

[1]Zhang L,Wang F,Wang L,et al.Prevalence of chronic kidney disease in China:a cross-sectional survey[J].Lancet,2012,379(9818)：815-822.

[2]劉蘭英，王耀獻，劉尚建．慢性腎衰竭中醫病機淺析[J]．中國中醫急癥，2010，19(3)：453-454．

[3]孫偉毅，潘麗歆.張琪教授診治慢性腎衰竭學術思想淺探[J].中醫藥學報，2011，39(2):71-72.

[4]鄭新，熊維建．國醫大師鄭新[M]．重慶：重慶出版社，2015：123-128．

[5]陳原，張國英，黃建平，等．補腎膠囊和腎衰靈對慢性腎衰竭大鼠腎功能的影響[J]．重慶醫學，2004，33(8)：1257-1258．

[6]Schelling JR.tubular atrophy in the pathogenesisi of chronic kidney disease progression[J].Pediatr Nephrol,2016,31(5):693-706.

[7]Yang CC,Yip HK,Chen KH,et al.Impact of impaired cardiac function on the progression of chronic kidney disease-role of pharmacomodulation of valsartan [J].Am J Transl Res,2017,9(5):2548-2566．

[8]Srichai MB,Hao CM,Davis L,et al.Apoptosis of the thick ascending limb results in acute kidneyinjury[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(8):1538-1546.

[9]Ratliff BB,Abdulmahdi W,Pawar R,et al.Oxidant mechanisms in renal injury and disease[J]．Antioxid Redox Signal,2016,25(3):119-146.

[10]Granata S,Gassa AD,Tomei P,et al.Mitochondria:a new therapeutic target in chronic kidney disease[J].Nutr Metab,2015(25):10.

[11]Baek jh,Zeng R,Menke JW,et al.IL-34 mediates acute kidney injury and worsens subsequent chronic kidney disease[J].J Clin Invest,2015,125(8):3198-3214.

[12]Mcllwain DR,Berger T,Mak TW.Caspase function in cell death and disease[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,7(4):a026716.

[13]He YJ,Chen WH,Hu YC,et al.Eadenophorum induces cell cycle and apoptosis of renal cells through mitochondrial pathway and caspase activation in saanen goat[J].PLoS One,2015,10(9):e0138504.

[14]Chien CT,Chang TC,Tsai CY,et al.Adenovirus-mediated bcl-2 gene transfer inhibits renal ischemia/reperfusion induced tubular oxidative stress and apoptosis[J].Am J Transplant,2005,5(6):1194-1203.

[15]Basile D,Anderson MD,Sutton TA.Pathophysiology of acute kidney injury[J].Compro Physiol,2012,2(2):1303-1353.

Effectofnourishingkidney,activatingbloodandexpellingtoxinmethodChinesemedicineonrenalcellsapoptosisinCKDrats*

LiYing1,TangJia1,XiongWeijian1,SongNa2,LaiZonglang2,ZhouXin3,ZhongJin1△

(1.DepartmentofNephrology;2.DepartmentofOncology;3DepartmentofEndocrinology,ChongqingMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021,China)

ObjectiveTo observe the curative effect of nourishing kidney,activating blood and expelling toxin method Chinese medicine on chronic kidney disease (CKD) rats and influence on cellular apoptosis.MethodsThe UUO animal model was adopted.SD male rats were divided into the sham operation group,UUO model group,Chinese medicine low dose group and high dose group.The renal function was measured by the automatic biochemical analyzer,the renal histopathologic change was observed by HE staining,the renal tissue apoptosis rate was observed by TUNEL as well as the protein expression levels of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot.ResultsCompared with the UUO model group,the levels of serum creatinine(Scr) and urea nitrogen(BUN) in Chinese medicine various doses groups were significantly decreased(P<0.05).In the UUO pathologic observation,renal tubular epithelial cells apoptosis,necrosis,exfoliation,inflammatory cells infiltration were found in the model group,the renal damage in the Chinese medicine various doses groups were slighter compared with the UUO group(P<0.05).The TUNEL method detection showed that the cellular apoptosis number in the UUO group was significantly increased compared with the sham operation group,the Chinese medicine various doses groups could significantly decrease the apoptosis number(P<0.05).Compared with the UUO model group,the level of Bcl-2 in the Chinese medicine treatment groups was markedly up-regulated,the Bax level was down-regulated,and the ratio of Bcl-2/Bax was increased(P<0.05).Above results all showed the dose dependent manner.ConclusionThe nourishing kidney,activating blood and expelling toxin method Chinese medicine can obviously down-regulate serum Scr and BUN levels,inhibits the renal cells apoptosis in UUO rat and regulates the Bcl-2 and Bax levels.

chronic kidney disease；drug therapy；apoptosis；the chinese herbs with the function of activating the blood and removing the blood stasis;Bcl-2/Bax

R-33

A

1671-8348(2017)26-3611-03

2017-02-22

2017-06-06)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.004

重慶市基礎科學與前沿技術研究項目(cstc2017jcyjAX0465)。

黎穎(1983-)，主治醫師，博士，主要從事慢性腎臟病方面研究。△

，E-mail:120852723@qq.com。