低劑量低分子肝素對內(nèi)毒素誘發(fā)的急性肺損傷的影響*

劉 玉，劉紹正，王先鋒，王義橋

(1.皖北煤電集團總醫(yī)院麻醉科,安徽宿州 234011；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,合肥 230032)

論著·基礎(chǔ)研究

低劑量低分子肝素對內(nèi)毒素誘發(fā)的急性肺損傷的影響*

劉 玉1，劉紹正1，王先鋒1，王義橋2

(1.皖北煤電集團總醫(yī)院麻醉科,安徽宿州 234011；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,合肥 230032)

目的探討低劑量低分子肝素(LMWH)對內(nèi)毒素(LPS)誘發(fā)的急性肺損傷(ALI)的影響。方法選取36只雄性SD大鼠分為3組：正常對照組(A組),LPS組(B組)和LPS+LMWH組(C組)，每組12只。B、C組腹腔注射6 mg/kg LPS 誘發(fā)ALI。C組腹腔注射低分子肝素100 U/kg,B組腹腔注入同等容積的生理鹽水。6 h 后處死動物,光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理改變，行動脈血氣分析、檢測肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量(W/D)比值和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白濃度；測定肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性、丙二醛(MDA)水平；ELISA法測定血漿中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)及白細胞介素-6(IL-6)水平。結(jié)果B、C組PaO2、pH值低于A組，C組與B組相比明顯升高(P<0.05)。 B、C組大鼠肺W/D、BALF總蛋白及肺組織MDA、MPO水平明顯高于A組(P<0．01)；C組與B組相比，肺W/D、BALF中蛋白及肺組織MDA、MPO水平明顯下降(P<0．05)。B、C組大鼠血漿中TNF-α、IL-1β及IL-6水平較A組明顯升高(P<0．01)，而C組較B組明顯降低(P<0.01)。結(jié)論LMWH處理能夠減輕LPS誘發(fā)的急性肺損傷。

肝素，低分子量；內(nèi)毒素；急性肺損傷；腫瘤壞死因子α

膿毒血癥導(dǎo)致機體發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，隨之造成低灌注和多器官衰竭，包括急性肺損傷(ALI)，因此調(diào)節(jié)或減輕內(nèi)毒素(LPS)造成的系統(tǒng)性炎癥成為當前眾多學(xué)科研究的重點。肝素是臨床上常用的抗凝劑，幾個動物實驗和臨床研究證實肝素能夠減輕膿毒血癥導(dǎo)致的肺、腸等損傷[1-3]。離體研究也證實肝素能夠直接抑制中性粒細胞激活，減少LPS誘發(fā)的白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素6(IL-6)生成[4-5]。膿毒血癥時機體凝血系統(tǒng)變化快，而普通肝素抗凝活性較強，因此在膿毒血癥時使用受到限制[6]。離體研究證實，在不產(chǎn)生抗凝效應(yīng)情況下的低劑量低分子肝素(LMWH)較大劑量低分子肝素及普通肝素能更有效地抑制中性粒細胞惡化[7]。因此，本實驗通過腹腔注射脂多糖制作膿毒血癥模型來觀察LMWH對LPS誘發(fā)的ALI及系統(tǒng)炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1材料 健康清潔級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。所有大鼠均飼養(yǎng)在溫度25 ℃，濕度50%，明暗交替各12 h的環(huán)境中，自由進食和飲水，實驗前12 h禁食不禁飲。

1.2方法

1.2.1實驗方案 36只大鼠分為3組：正常對照組(A組)， LPS組(B組)和LPS+LMWH組(C組)，每組12只。A組在相同時間段腹腔注射等容積的生理鹽水，B組和C組腹腔注射LPS(血清型055：B5，Sigma公司，美國)6 mg/kg誘發(fā)ALI,C組腹腔注射低分子肝素(齊魯制藥有限公司,批號6A0042C08)100 U/kg，B組腹腔注射同容積的生理鹽水。

1.2.2取材及指標測定 造模后6 h處死所有大鼠。左心室采血3 mL，1 mL用作動脈血氣分析，2 mL分離血清用作IL-1β、IL-6及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測。取部分右肺上葉組織制成10%肺組織勻漿，取右肺中葉肺尖組織留作測定肺W/D[肺W/D：取右肺中葉肺尖組織稱質(zhì)量為濕質(zhì)量(W),置于烤箱中60 ℃烘干至恒質(zhì)量為干質(zhì)量(D)，W/D=濕質(zhì)量/干質(zhì)量]。左肺用4 ℃無菌生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，每次灌洗量為3 mL，灌洗3次，記錄回收量。收集的支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織勻漿液分別于3 000 r/min離心15 min后取上清液于-70 ℃凍存。考馬斯亮藍染色法測定BALF中蛋白濃度。分光光度計法測定肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性、丙二醛(MDA)水平，ELISA法檢測血漿TNF-α、IL-6和 IL-1β水平，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。取小部分右下肺組織，甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

2 結(jié) 果

2.1動脈血氣分析 B組和C組氧分壓(PaO2)、pH值低于A組，C組與B組相比明顯升高(P<0.05)；3組間二氧化碳分壓(PaCO2)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組大鼠動脈血氣結(jié)果比較

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較

2.2肺W/D、BALF總蛋白及肺組織MDA、MPO水平的比較 B和C組大鼠肺W/D、BALF中蛋白及肺組織MDA、MPO水平明顯高于A組(P<0．01)；C組與B組相比，肺W/D、BALF中蛋白及肺組織MDA、MPO水平明顯下降(P<0．05)，見表2。

表2 3組大鼠肺W/D、BALF總蛋白及肺組織MDA、MPO

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較

2.33組大鼠血漿中TNF-α、IL-1β及IL-6水平 B、C組大鼠血漿中TNF-α、IL-1β及IL-6水平較A組明顯升高(P<0．01)，而C組較B組明顯降低(P<0.01)，見表3。

表3 3組血漿中TNF-α、IL-1β及IL-6水平

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.01，與B組比較

2.4肺組織HE染色結(jié)果 光鏡下觀察各組肺組織切片，A組肺組織正常，未見明顯充血和中性粒細胞浸潤；B組肺泡壁完整性破壞，肺泡腔內(nèi)中性粒細胞大量浸潤、肺間質(zhì)彌漫性出血；C組肺泡腔內(nèi)中性粒細胞較B組明顯減少，仍可見肺間質(zhì)出血，但較B組明顯減輕，見圖1。

A:A組；B：B組；C：C組

圖1光鏡下肺組織病理結(jié)果(HE，×400)

3 討 論

革蘭陰性菌感染產(chǎn)生大量LPS誘發(fā)SIRS從而導(dǎo)致感染性休克甚至死亡。肺臟是LPS入侵形成膿毒癥時最先累及的重要器官，一旦肺臟損壞，致死率明顯增加[8]。本研究采用腹腔注射LPS誘發(fā)ALI，劑量參照文獻[9]并略作調(diào)整，結(jié)果顯示在LPS注入6 h后B組與A組相比PaO2平均下降約37 mm Hg，下降幅度大于基礎(chǔ)值30%，達到樊毫軍等[9]推薦的ALI標準；同時本研究肺組織病理切片也證實LPS組肺臟病理損害達到ALI標準，故認為本研究ALI模型成功。本研究結(jié)果顯示，LMWH處理的C組PaO2盡管遠小于A組，但是與B組相比明顯上升(P=0.026)，說明低分子肝素處理能夠一定程度地改善LPS所致的低氧血癥；同時，C組的pH值較B組也有一定升高(P=0.001)，可能歸因于氧合的改善。盡管B、C組PaCO2略高于A組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是因為CO2彌散速度遠大于O2有關(guān)。

ALI病理表現(xiàn)為炎性細胞大量滲透、蛋白滲出、肺間質(zhì)乃至肺泡水腫。本研究病理結(jié)果顯示B組病理損害嚴重符合ALI特征，而C組病理改變較B組明顯減輕。同時，B組肺W/D和BALF總蛋白較A組明顯增加也從側(cè)面印證了LPS注射誘發(fā)了ALI的形成；LMWH處理的C組其肺W/D和BALF總蛋白及MPO、MDA水平較B組亦明顯降低。這些結(jié)果說明LMWH能夠削弱LPS導(dǎo)致的肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞損傷、抑制中性粒細胞聚集、減輕肺水腫的程度。

促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6受到LPS刺激會迅速產(chǎn)生并且促進膿毒血癥發(fā)展，從而誘發(fā)ALI，因此抑制炎性介質(zhì)及相關(guān)的信號通路成為治療膿毒血癥的一個潛在治療手段[10]。本研究中在LPS注入6 h后B組和C組血清中TNF-α、IL-1β及IL-6較A組明顯升高，而C組TNF-α、IL-1β及IL-6較B組有一定的降低(P<0.01)，說明低分子肝素處理能夠通過減少這些促炎細胞因子的產(chǎn)生，這與Ning等[11]的研究結(jié)果一致。

總之，在LPS誘發(fā)的ALI中早期應(yīng)用低分子肝素能夠抑制促炎細胞因子的釋放、抑制中性粒細胞的激活、減輕肺毛細血管的通透從而改善機體的氧合。其具體的抗炎機制及對膿毒癥時凝血狀態(tài)的影響仍然需要進一步探討。

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Effectsoflow-doselowmolecularweightheparinonlipopolysaccharide-inducedacutelunginjury*

LiuYu1,LiuShaozheng1,WangXianfeng1，WangYiqiao2

(1.DepartmentofAnesthesiology,WanbeiCoalElectricityGroup,Suzhou,Anhui234011,China；2.DepartmentofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230032,China)

ObjectiveTo explore the effect of low-dose low molecular weight heparin(LMWH) on acute lung injury(ALI) induced by lipopolysaccharide(LPS).MethodsThirty-six male SD rats were divided into 3 groups:normal control group(A),LPS group(B) and LPS plus LMWH group(C),12 cases in each group.ALI was induced by intraperitoneal injection of LPS 6 mg/kg in group B,C.The group C accepted intraperitoneal injection of LMWH 100 U/kg,the groups B accepted intraperitoneal injection of the same volume of normal saline.The animals were killed after 6 h,the pathological changes of the lung were observed under light microscope.Arterial blood gases,lung wet to dry ratio (W/D) and protein content in BALF were detected;the levels of MPO and MDA in lung tissue were determined.The levels of serum interleukin1β(IL-1β),IL-6 and tumor necrosis factor-α(TNF-α) were determined by ELISA method.ResultsThe PaO2and pH values in the group B and C were significantly lower than those in the group A,and which in the group C were markedly increased compared with those in the group B(P<0.05);the lung W/D ratio,protein content in BALF,MDA and MPO levels in the lung tissue in the group B and C were significantly higher than those in the group A(P<0.01),while the lung W/D ratio,protein content in BALF,MDA and MPO levels in the lung tissue in the group C were significantly decreased compared with the group B (P<0.05).The levels of plasma TNF-α,IL-1β and IL-6 levels in the group B and C were markedly increased compared with the group A,while which in the group C were significantly decreased compared with those in the group B (P<0.01).ConclusionThe LMWH treatment might attenuate LPS-induced acute lung injury.

heparin,low-molecular-weight；lipopolysaccharide；acute lung injury；tumor necrosis factor-α

A

1671-8348(2017)26-3608-03

2017-02-18

2017-06-06)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.003

安徽省衛(wèi)生廳青年基金項目(09B125)。

劉玉(1976-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事危重癥急救與臟器保護方面研究。