我國豬傳染性胃腸炎的流行現狀及實驗室診斷技術研究進展

祖立闖，王 芳，劉愛華，王金良，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州市動物疫病預防與控制中心，濱州 256600；3.山東省利津縣畜牧局，利津 257400；4.山東省濱州畜牧獸醫研究院，濱州 256600）

我國豬傳染性胃腸炎的流行現狀及實驗室診斷技術研究進展

祖立闖1，王 芳2，劉愛華3，王金良4，李 峰4，沈志強1，4

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州市動物疫病預防與控制中心，濱州 256600；3.山東省利津縣畜牧局，利津 257400；4.山東省濱州畜牧獸醫研究院，濱州 256600）

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起豬的以腹瀉、嘔吐、脫水、逐漸消瘦為主要特征的一種急性、高度接觸性腸道傳染病[1]，各年齡段的豬群均易感，對仔豬的危害最大，仔豬日齡越低死亡率越高，存活的仔豬生長發育嚴重受阻，生長緩慢，飼料轉化率明顯降低，生產性能下降[2]，給我國養豬業帶來了嚴重的經濟損失。筆者就目前我國TGE的流行現狀及各種實驗室診斷技術的最新研究進展進行綜述，旨在掌握我國豬群中TGE的流行現狀與流行特點，為逐步提高我國TGE實驗室診斷水平，以及為我國TGE的綜合防控提供參考。

1 病毒分離鑒定情況

如表1所示，自2006年以來的近10年中，我國研究學者先后在我國四川、福建、吉林、陜西、甘肅、黑龍江、江蘇、山東、遼寧、河北等10個省共分離鑒定出17株TGEV，TGEV強毒株的感染由中部地區逐步向東部沿海以及北方地區逐步擴散，現在我國大部分養豬密集地區均已有TGEV病毒感染并成功分離毒株的報道。

2 流行病學監測情況

近10年我國研究學者對國內TGEV的感染情況進行了大量的流行病學監測，筆者通過對監測結果的整理與匯總，分析出近10年中我國豬群TGEV流行的幾個顯著特點。

2.1 流行范圍廣

如表2所示，TGEV的流行已經遍布了我國黑龍江、貴州、福建、廣西、北京、河北、安徽、浙江、江蘇、青海、河南、廣東、遼寧、山東、內蒙古、上海、江西、四川、山西、吉林、陜西等21個省市。

表1 近10年TGEV病毒分離鑒定情況匯總

2.2 感染率整體不高

如表2所示，在2007—2016年的39篇流行病學監測文獻中，TGEV整體陽性感染率在0～31.86%范圍內，其中陽性感染率超過10%的流行病學監測文獻僅有10篇，而陽性感染率在5%～10%的文獻有12篇，陽性感染率低于5%的文獻達17篇，陽性感染率在10%以下文獻占總文獻的74.36%，表明TGEV在我國發病豬群中的感染率整體穩定在較低水平，這與我國對TGEV防控工作的重視密不可分。

2.3 隱性感染普遍存在

如表2所示，2008—2009年貴州省健康豬群中TGEV抗體陽性率為0.41%，2015—2016年陜西省健康豬群中TGEV抗體陽性率為5.36%，2016年河南省健康豬群中TGEV抗體陽性率為1.5%，2012—2013年北京健康豬群中TGEV病原感染率為2.58%，2016年福建省健康豬群中TGEV病原感染率為28.9%。表明外觀健康豬群仍可檢測出TGEV病原或抗體，健康豬群中普遍存在TGEV隱性感染。

2.4 區域性流行特點顯著

如表2所示，不同地區感染率差異較大，如2012年青海的發病豬樣品的感染率達30.0%，而2012年安徽發病豬樣品的感染率僅為10.8%；如2016年福建健康豬樣品的感染率達28.9%，而2016年河南健康豬樣品的感染率僅為1.5%。

表2 近10年TGEV流行病學監測情況匯總

2.5 與其它病原的混合感染情況較嚴重

如表3所示，TGEV與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（PoRV）、豬嵴病毒（PKV）普遍存在二重、三重的混合感染，其中在部分不同地區與PEDV的二重混合感染率最高達29.2%，與PEDV、PoRV三重混合感染率最高達20.0%，與PEDV、PKV三重混合感染率最高達3.84%，混合感染增加了疫病的診斷與防控難度，造成的經濟損失更加巨大，應加強重視。

表3 近10年我國豬群TGEV與其它致病原混合感染情況匯總

3 實驗室診斷技術

TGEV與PEDV、PoRV等疫病的臨床表現極其相似，均表現為嘔吐、水樣腹瀉、脫水、逐漸消瘦等特征，且TGEV經常與PEDV、PoRV等疫病混合感染，增加了TGEV臨床診斷的難度，故目前對TGEV感染的確診主要依靠實驗室診斷技術，包括病毒的分離與鑒定、分子生物學和免疫學診斷技術。

3.1 病毒的分離與鑒定

病毒分離與鑒定方法一直是動物病毒病實驗室確診的經典方法，但該方法存在試驗周期長，操作較繁瑣，不適合臨床快速診斷。滿坤等[19]將采集的病死豬小腸內容物處理后接種ST細胞，經過12代盲傳后開始出現細胞顆粒增多、圓縮、損傷和脫落等典型細胞病變，分離病毒被TGEV特異性血清中和后接種細胞不出現細胞病變，仔豬口服分離病毒后出現水樣腹瀉、糞便呈乳白色或黃綠色、嘔吐、脫水等癥狀，經過對分離病毒的ORF3基因序列進行分析證實分離毒株為TGEV。

3.2 分子生物學診斷技術

3.2.1 RT-PCR及多重RT-PCR方法 RT-PCR首先以病毒的基因組RNA為模板進行反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，是疾病病原檢測中最常用的一種分子生物學診斷技術。多重RT-PCR方法是在單一RT-PCR檢測方法的基礎上建立起來的，可在同一個反應體系中加入多對引物同時對多個目的基因進行擴增，可在一次PCR反應過程中檢測到多個致病原。張作華等[59]根據TGEV N基因序列設計了1對特異性引物，建立了檢測TGEV的RT-PCR方法，該方法檢測豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、PEDV均為陰性，可檢測到1×10-3μg/μL的TGEV RNA，通過對126份臨床疑似為TGEV感染病料的檢測證明該RT-PCR檢測方法可用于臨床上TGEV感染引起的傳染病病原學檢測。李麗敏等[60]分別針對PEDV和TGEV的N基因、PoRV的VP7基因設計引物，建立了檢測PEDV、TGEV和PoRV的多重RT-PCR方法，該方法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、CSFV、PRV及PCV2等病毒均為陰性，可以檢測到PEDV、TGEV和PoRV的最低核酸濃度分別為16.07、803.9和321.5 μg/L，該多重RT-PCR和PEDV、TGEV、PoRV單項RT-PCR的符合率分別為96.77%、93.54%和93.54%，該多重RT-PCR能夠快速鑒別檢測PEDV、TGEV和PoRV 3種病毒，可用于PEDV、TGEV與PoRV的臨床快速鑒別診斷和流行病學調查。

3.2.2 熒光RT-PCR及多重熒光RT-PCR方法 熒光定量RT-PCR技術融匯了常規RT-PCR技術靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術的高敏感性和高精確定量的優點，但該方法對儀器設備和操作人員技術水平要求均較高。李子祥等[61]針對TGEV S基因的保守序列設計引物，優化反應體系和擴增條件，建立了基于SYBR GreenⅠ染料的實時熒光定量PCR檢測方法，該方法標準曲線線性關系良好（r=0.997），擴增效率高，檢測靈敏度可達10拷貝/μL，該方法檢測124份臨床疑似TGEV病料，陽性率為13.7%，可用于獸醫臨床上TGEV的快速檢測和流行病學分析。許夢怡[62]分別根據TGEV、PEDV、PoRV的M、M、VP2基因序列，設計了3對質粒標準品引物和3組熒光RT-PCR引物和探針，通過優化引物、探針濃度和退火溫度，成功建立了3種病毒的TaqMan探針熒光定量PCR方法。該方法對TGEV、PEDV、PoRV的檢測靈敏度分別為2.49拷貝/μL、4.36拷貝/μL、4.96拷貝/μL。組內和組間重復試驗的變異系數均不超過5%，檢測PRV、PCV1、PRRSV等病毒均為陰性，在40份臨床病料樣品檢測中三重熒光RT-PCR方法的檢測結果與單一熒光RT-PCR方法一致，三重熒光RT-PCR方法具有很好的臨床應用價值。

3.2.3 RT-LAMP方法 環介導等溫擴增方法（LAMP）是2000年以后發展起來的一種新型核酸擴增技術，只需在恒溫條件下就能完成擴增反應，不需要特殊儀器設備，并且擴增結果可通過反應體系的濁度或加入染料來直觀判斷，特別適合在現場和基層部門應用，但LAMP方法容易形成氣溶膠污染，造成假陽性的結果。高睿澤等[63]根據TGEV N基因序列設計2對RT-LAMP引物，建立針對TGEV的RT-LAMP快速檢測方法，該方法在63℃恒溫下作用50 min，使TGEV獲得了高效率特異性擴增，檢測PEDV等其它豬易感病毒均為陰性，可檢測到131.4fg/μL的目標病毒，比普通RT-PCR的靈敏度高3個數量級，反應結束后加入SYBR GreenⅠ在紫外燈下觀察顏色變化，陽性擴增產物呈現綠色熒光，該RTLAMP對40份臨床樣品的檢測結果與RT-PCR和ELISA的符合率均為100%，為TGE的臨床快速診斷與流行病學調查提供了一種簡單、快速和高效的技術手段。

3.2.4 基因芯片方法 基因芯片技術是近年來迅速發展起來的一門新技術，在基片上點陣排列一系列靶基因，與熒光素等標記的探針分子在同一條件下進行核酸雜交，經過共聚焦激光掃描儀掃描、利用數據分析軟件獲得雜交結果，具有自動化、平行性和高通量等潛在優勢，能同時對多種疾病進行檢測。滑翔等[64]分別根據 PEDV 基因（S、M）、TGEV 基因（S、N）、PoRV 基因（VP7、NSP4）的保守區設計引物擴增靶基因，進行PEDV-TGEV-PoRV的cDNA陣列設計，構建了能夠擴增PEDV、TGEV、PoRV的cDNA芯片，該cDNA芯片檢測PRRSV、CSFV、豬乙型腦炎病毒（JEV）、PRV均為陰性，芯片的最低檢測質量濃度為20 pg/μL，同一張芯片可重復使用至少7次，該PEDV-TGEV-PoRV診斷cDNA芯片具有良好的特異性、靈敏性和重復性，為PEDV、TGEV、PoRV的鑒別診斷提供了新的高通量檢測技術。

3.3 免疫學診斷技術

3.3.1 ELISA方法 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是繼免疫熒光和放射性同位素免疫技術之后發展起來的一種新型的免疫酶技術，該方法具有特異性高、敏感性強、重復性和穩定性好、操作簡便、快速等特點，非常適用于臨床大批量樣品的檢測。ELISA方法可用于測定抗原，也可用于測定抗體，主要有直接法、間接法、夾心法、競爭法（阻斷法），其中間接ELISA檢測抗體和雙抗夾心ELISA檢測抗原是動物疫病檢測中最常用的二種方法。

（1）間接ELISA方法。間接ELISA方法中首先用特異性抗原包被固相載體，加入待測抗體（一抗），待測抗體與包被固相抗原發生特異性結合；再加入酶標記的抗體（酶標二抗），酶標抗體與待測抗體發生特異性結合，再加入底物顯色液，底物顯色液與酶標抗體發生特異性結合，最后顯色顏色的深淺與待測抗體的量成正比。徐向偉等[65]將TGEV的N基因片段克隆到pET-28a載體中，轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞中進行誘導表達，以純化的重組N蛋白作為包被抗原，建立了檢測TGEV抗體的間接ELISA方法，該 ELISA方法檢測 PEDV、CSFV、PRRSV、口蹄疫病毒（FMDV）、PCV2等 5種病毒陽性血清均為陰性，該方法操作簡便、特異性好、敏感性高，可用于大規模臨床樣品的檢測。

（2）雙抗夾心ELISA方法。雙抗夾心ELISA方法中首先用捕獲抗體包被固相載體，加入待測抗原，待測抗原與捕獲抗體發生特異性結合，再加入檢測抗體（標記抗體），檢測抗體與待測抗原發生特異性結合，形成抗體-抗原-標記抗體免疫復合物，再加入底物顯色液，底物顯色液與檢測抗體發生特異性結合，最后顯色顏色的深淺與待測抗原的含量成正比。屈月等[66]以抗TGEV N蛋白單克隆抗體為包被抗體，純化的抗TGEV N蛋白多克隆抗體為檢測抗體，建立了TGEV雙抗體夾心ELISA方法，該ELISA的重復性變異系數小于10%，檢測PEDV、豬細小病毒（PPV）、CSFV、PoRV 等均為陰性，對 22份臨床豬糞便樣品的陽性檢出率為22.7%，與常規RT-PCR的符合率達81.8%，該雙抗體夾心ELISA方法檢測TGEV具有較高的特異性和敏感性，可以用于TGEV的病原學檢測。

3.3.2 IPMA方法 免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）是在感染病毒的多孔細胞培養板中加入待檢標本，再加入標有辣根過氧化物酶抗免疫球蛋白特異抗體，經底物顯色后利用光學顯微鏡即可觀察結果。朱蘊暖等[67]以TGEV N蛋白的單克隆抗體為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP為二抗，AEC過氧化物酶底物為顯色液，建立了檢測TGEV的IPMA方法。該方法中一抗的最佳使用濃度為0.5 ng/μL，二抗的最佳稀釋倍數為1∶2 000倍，經AEC顯色后TGEV感染的陽性細胞呈紅棕色，能檢測到101TCID50的病毒，檢測常見的PEDV、PoRV和PCV2等豬病病原均為陰性，為TGEV的實驗室診斷及TGEV在感染細胞中的定位和動態分布提供有效的檢測手段。

3.3.3 免疫膠體金方法 免疫膠體金技術是結合膠體金標記技術和免疫檢測技術發展起來的一種新型檢測技術，其以膠體金作為示蹤標志物，將其標記抗原或抗體后形成標記物，樣品中的待測物與標記物形成的絡合物通過層析作用在層析材料上泳動，與層析材料上針對該待測物的受體發生免疫反應形成免疫復合物，免疫復合物中的膠體金大量聚集形成肉眼可見的紅色或粉紅色斑點。具有簡便、快速、不需儀器設備、結果判斷直觀、無污染等優點，在動物疫病診斷尤其是基層獸醫實驗室現地診斷中得到了廣泛應用。常亮等[68]采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金顆粒，用TGEV單克隆抗體標記并包被在玻璃纖維膜上，另外將純化的TGEV單克隆抗體和羊抗小鼠抗體包被在硝酸纖維膜上，組裝成TGEV快速檢測試紙條，該試紙條檢出TGEV最低量為150 μg/mL，而檢測CSFV、PRRSV、大腸桿菌及沙門氏菌均為陰性，試紙條在常溫下可保存1年。膠體金試劑條具有快速、靈敏、特異、操作簡便等特點，非常適用于基層單位。

3.3.4 IFA方法 間接免疫熒光（IFA）檢測方法可利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原的定位，且該方法具有特異性強、敏感性高和操作簡便等特點，在病原檢測、病毒感染及致病機理研究中得到廣泛應用。朱蘊暖等[69]將TGEV接種PK-15細胞后，以抗TGEV N蛋白的單克隆抗體為一抗，熒光素FITC標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，通過反應條件優化，建立了TGEV的IFA檢測方法。該方法檢測常見的PEDV、PoRV和 PCV2等豬病病原均為陰性，為TGEV的臨床鑒別診斷提供了一種免疫學診斷技術。

4 小結與展望

現階段的流行現狀分析表明TGEV在我國豬群中呈散發性、區域性流行，其整體感染率一直穩定在較低水平，表明我國采取的TGE綜合防控措施發揮了功效，但分析中發現TGEV的隱性感染以及與其它致病原的混合感染均普遍存在，應加強重視。對于TGEV的各種實驗室診斷技術，病毒分離鑒定、IPMA、IHA、基因芯片方法均存在試驗條件要求高、操作復雜、過程繁瑣、費用成本高等條件限制，不利于基層實驗室快速檢測。RT-LAMP和膠體金方法對儀器設備要求較低，但敏感性太高，易導致假陽性。RT-PCR、ELSA方法操作簡單、檢測快速、高通量，是目前TGEV診斷和流行病學監測使用的主要方法，但RT-PCR方法對擴增產物進行電泳時需使用溴化乙錠（EB），對環境和人體健康產生一定的威脅。熒光RT-PCR方法彌補了常規RT-PCR不能定量以及EB的污染問題，但對儀器、試劑、操作人員技術水平要求均較高，有條件的實驗室可選擇使用。相信隨著分子生物學和免疫學檢測技術的不斷完善與標準化，以及我國對TGE研究的不斷深入和防控措施的不斷完善，TGE的各種實驗室診斷技術必將會走向不斷成熟與完善，TGE的流行也將會得到進一步控制，從而逐步實現TGEV在我國的凈化。

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（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2017)05-0123-06

2017-08-09

山東省自然科學基金資助項目（ZR2016CM35）；山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-08-17）

祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病診斷技術研究工作.E-mail：zulichuang2008@126.com