直接抗人球蛋白試驗陽性在慢性重型乙型肝炎患者貧血中的臨床意義

覃婉元，梅 城，彭 芳，王 娟，周曉英，周蓉蓉，范學工，李 寧

(1 中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008； 2 中國人民解放軍空軍航空醫學研究所附屬醫院，北京 100089)

·論著·

直接抗人球蛋白試驗陽性在慢性重型乙型肝炎患者貧血中的臨床意義

覃婉元1，梅 城1，彭 芳1，王 娟1，周曉英2，周蓉蓉1，范學工1，李 寧1

(1 中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008； 2 中國人民解放軍空軍航空醫學研究所附屬醫院，北京 100089)

目的探討直接抗人球蛋白試驗(DAT)陽性在慢性重型乙型肝炎患者貧血中的臨床意義。方法對30例健康人、30例慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者和50例慢性重型乙型肝炎(慢重肝)患者紅細胞相關參數及DAT進行檢測，并對影響DAT陽性的臨床相關因素進行分析。結果慢重肝患者紅細胞計數、血紅蛋白(Hb)濃度以及紅細胞壓積(HCT)均低于慢乙肝患者和健康組(P<0.05)，而慢重肝患者紅細胞體積分布寬度(RDW)高于慢乙肝和健康組(P<0.05)；慢重肝患者、慢乙肝患者和健康組DAT陽性率分別為62.82%、13.33%和0。DAT陽性的慢重肝患者紅細胞計數、Hb濃度和HCT均低于相應DAT陰性患者(均P<0.05)，RDW卻高于DAT陰性慢重肝患者(P=0.001)；慢重肝患者紅細胞毛細管分離后，衰老紅細胞的DAT陽性強度高于年輕紅細胞DAT陽性強度(P<0.001)；在慢重肝患者中，DAT的陽性和陰性的患者在性別、年齡、丙氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、補體C3、C-反應蛋白及是否并發糖尿病方面存在差異(均P≤0.05)。結論慢重肝患者貧血的產生可能與衰老紅細胞吸附抗體所致的免疫性溶血有關。

乙型肝炎; 慢性乙型肝炎； 慢性重型乙型肝炎； 直接抗人球蛋白試驗; 紅細胞相關參數; 貧血

[Chin J Infect Control，2017，16(10)：904-908]

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一個全球性的衛生問題，全世界慢性感染者約有3.5億人，每年約100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發性肝細胞癌。我國是HBV高感染區，約1億人感染HBV，每年有近30萬人死于各類末期肝病[1]。HBV可導致機體自身免疫功能紊亂，產生多種自身抗體和補體，這些抗體和補體被紅細胞膜吸附后可導致紅細胞致敏，從而被巨噬細胞識別并吞噬破壞[2-3]。病毒性肝炎患者尤其是慢性重型乙型肝炎患者常出現貧血，加重了病情，但具體原因尚不清楚[4]。直接抗人球蛋白試驗(direct antiglobulin testing, DAT)是檢查被檢紅細胞是否已被不完全抗體或補體所致敏方法，常用于自身免疫性疾病等的診斷。在病毒性疾病中，如在人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者中，DAT被認為是反映輕度貧血的重要指標[5]。在本研究中，我們分析了慢性重型乙型肝炎(以下簡稱慢重肝)患者紅細胞參數，并探討了慢重肝患者貧血的產生與紅細胞膜吸附抗體的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇中南大學湘雅醫院感染病科2015年10月—2016年5月的門診及住院患者，包括30例慢性乙型肝炎患者(慢乙肝組)和78例慢性重型乙型肝炎患者(慢重肝組)，乙型肝炎患者按2000年9月修訂的《病毒性肝炎防治方案》[6]中的診斷標準進行診斷。排除標準：(1)藥物、酒精及其他中毒因素所致的肝炎、自身免疫性肝炎、重度脂肪肝、其他嗜肝病毒重疊感染；(2)存在其他臟器嚴重受損；(3)曾接受過干擾素治療；(4)合并再生障礙性貧血。(5)采集標本前患者曾輸注過血制品。40例健康對照為本院健康體檢者(健康組)。健康組、慢乙肝組、慢重肝組在年齡、性別方面無統計學差異，資料具有可比性。

1.2 主要試劑和儀器 BIO-RAD微柱凝膠抗人球蛋白檢測卡(批號50531.07.13含IgG+C3d抗人球蛋白試劑)，BIO-RAD微柱凝膠抗體分型卡(批號：50830.76.03含IgG/C3d/C3c/IgA/IgM)?？骨虻鞍追磻▽Ｓ秒x心機(達亞美公司)，全自動血細胞記數儀及全套試劑(美國Backman公司)，毛細管血液離心機TG12M(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 外周血細胞參數分析 采用全自動血細胞記數儀，取靜脈血1 mL加入 EDTA-K2抗凝劑試管中，混勻后2 h內置儀器中進行自動記數，得相應數據。

1.3.2 直接抗人球試驗 采集患者 EDTA-K2抗凝血2 mL，3 400 rpm離心3 min分離血漿與血清，將紅細胞用生理鹽水洗滌3次，并用低離子介質配成0.8%的紅細胞懸液。將0.8%的紅細胞懸液50 μL加入到微柱凝膠抗人球蛋白檢測卡中，微柱凝膠反應卡專用離心機1 030 rpm離心10 min，觀察結果。紅細胞因抗原抗體反應而發生凝聚或凝集時，它們不能通過微柱管反應腔內的凝膠介質，而留在凝膠的上端或中上部，提示直接抗人球蛋白實驗陽性。

1.3.3 分離衰老和年輕紅細胞 連接毛細管及吸耳球，吸取20 μL左右紅細胞，用專用離心機將新老紅細胞分離(10 000 rpm，10 min)，然后進行DAT試驗。

2 結果

2.1 乙型肝炎患者紅細胞參數的檢測 健康組、慢乙肝組、慢重肝組患者紅細胞(RBC)計數、血紅蛋白濃度(Hb)、紅細胞比積(HCT)、紅細胞體積(RDW)比較，差異均有統計學意義(均P<0.001)。組間比較：慢重肝患者RBC計數、Hb及HCT均低于健康組、慢乙肝患者(均P<0.05)；而RDW高于健康組及慢乙肝患者(均P<0.05)；三組紅細胞參數平均紅細胞體積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 乙型肝炎患者紅細胞參數測定結果

*：與健康組相比，P<0.05；#：與慢乙肝組相比，P<0.05

2.2 乙型肝炎患者DAT檢測結果 慢重肝組患者DAT陽性率為62.82%，高于慢乙肝組患者和健康組(P<0.001)；而慢乙肝組和健康組比較差異無統計學意義(P=0.112)。通過微注凝膠卡氏法進行抗體補體分型，發現乙型肝炎DAT陽性患者紅細胞吸附的抗體均為IgG型。見表2。

2.3 慢重肝DAT陽性患者與DAT陰性患者紅細胞參數比較 DAT陽性的慢重肝患者RBC計數、Hb濃度和HCT均低于相應 DAT陰性患者(均P<0.05)，RDW卻高于DAT陰性慢重肝患者(P<0.05)。紅細胞參數MCV、MCH、MCHC在DAT陰性組和陽性組兩組間比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表2 乙型肝炎患者DAT檢測結果

*：與健康組相比，P=0.112；#：與慢乙肝組及健康組相比，P<0.001

表3 慢重肝DAT陽性患者與DAT陰性患者紅細胞參數比較

2.4 新老紅細胞DAT陽性強度的比較 對19例DAT陽性的慢重肝患者紅細胞進行毛細管分離(10 000 rpm，10 min)，分別對分離后的遠端的衰老紅細胞和近端的年輕紅細胞進行DAT 檢測。陽性強度判讀為陰性、1+、2+、3+、4+，分別計分為0、5、8、10、12分[7]，對計分結果統計分析，遠端的衰老紅細胞DAT陽性強度高于近端的年輕紅細胞(P<0.001)。見圖1。

2.5 慢重肝患者DAT陽性臨床相關因素分析 慢重肝患者DAT陽性率與其它參數的關系如表4所示，DAT陽性率與患者年齡、性別、總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、C-反應蛋白(CRP)及補體C3值相關(均P≤0.05)，提示DAT陽性與肝損傷程度相關，DAT陽性的患者平均年齡大于陰性患者(47.04±14.57 vs 40.51±11.33)，男性陽性率高于女性(P=0.021)。DAT的陽性率與慢重肝患者PCT、白細胞計數、補體C4及IgG、IgA、IgM等參數無關，HBV病毒載量在陽性患者和陰性患者之間也無統計學差異(均P>0.05)。此外，合并糖尿病的患者DAT陽性率亦高于未合并糖尿病患者(P=0.022)。見表4。

圖1 衰老紅細胞和年輕紅細胞DAT比較

表4 慢重肝患者DAT陽性臨床相關因素分析

WBC：白細胞計數；IgA：免疫球蛋白A；IgM：免疫球蛋白M；AST：天門冬氨酸氨基轉移酶；PCT：降鈣素原；HBV-DNA：乙型肝炎病毒DNA

3 討論

紅細胞是人體血液中數量最多的細胞，具有運輸、攜氧、調節機體內環境穩定等功能，這依賴于膜蛋白與Hb的作用[8-9]。紅細胞膜的改變與人類疾病密切相關，紅細胞膜蛋白的缺損可導致貧血，如橢圓形紅細胞增多癥或球形紅細胞增多癥等[10]。

本文研究表明，慢重肝患者出現輕中度貧血。原因包括多個方面，一方面隨著病患肝細胞大量壞死，肝貯備鐵、葉酸、維生素B12的功能急劇下降，導致攝取和合成造血物質的能力降低[11]；另一方面，在慢重肝患者肝細胞大量壞死，釋放大量的腫瘤壞死因子(TNF)和多種細胞因子(IL-1、IL-6)，內毒素增多，可能直接干擾骨髓的造血能力，從而導致異常紅細胞的生成[12]。同時，這些物質又可直接作用于外周血中成熟的紅細胞，改變紅細胞膜結構，使紅細胞表面抗原性發生改變，或發生異形性變化，發生內源性溶血[13]。此外，HBV可導致機體自身免疫功能紊亂，產生多種自身抗體和補體，這些抗體和補體被紅細胞膜吸附，使紅細胞致敏并被巨噬細胞識別并破壞，出現免疫性溶血[2-3]。研究[12, 14]表明，RDW是慢重肝患者3個月病死率的獨立預測因素，炎性反應通過削弱鐵代謝、抑制促紅細胞生成素的生成和縮短RBC的壽命來使RDW增高。RDW增高可反映一種潛在的炎性反應狀態，導致臨床預后不良的同時損害了RBC的成熟而引起貧血。

DAT是檢查紅細胞是否被不完全抗體或補體致敏，常用于自身免疫性疾病的診斷，如新生兒溶血病、自身免疫性溶血性貧血。DAT試驗陽性在某些疾病如HIV感染患者中被認為是反映貧血的一個實驗指標[15]。有關病毒性肝炎患者貧血與DAT相關性的研究僅見于零星的報道。本研究結果顯示，隨著乙型肝炎患者病情的加重，DAT陽性率逐漸上升，慢重肝患者陽性率高達62.82%，并且DAT陽性患者貧血程度高于DAT陰性患者，這些結果表明，DAT是慢重肝貧血的一個實驗指標，并在一定程度上可反映乙型肝炎患者病情的嚴重程度。進一步毛細管離心分離慢重肝遠端衰老紅細胞和近端年輕紅細胞，發現遠端衰老紅細胞DAT陽性強度強于近端年輕紅細胞，提示DAT陽性可能是紅細胞衰老的標志，同時也說明致敏的遠端紅細胞吸附的抗體更多，更容易被吞噬細胞吞噬破壞。

DAT陽性患者平均年齡大于陰性的患者，男性DAT陽性率高于女性，這可能與疾病的人群分布有關，慢性乙型肝炎多發生于青壯年男性，具體原因有待進一步研究。二甲雙胍是糖尿病患者最常用的口服降血糖藥物，有文獻[16-17]報道二甲雙胍會造成紅細胞溶血，本研究結果顯示慢重肝合并糖尿病患者DAT陽性率增高，提示紅細胞吸附抗體與患者溶血發生可能有關。

總之，本文的結果顯示在不同的疾病階段，紅細胞參數可隨肝病病情變化、肝臟損害的程度而改變，紅細胞參數可在一定程度上反映乙型肝炎患者的免疫狀況。通過檢測紅細胞吸附的不完全抗體，提示慢重肝患者貧血的產生可能與紅細胞抗體的存在有關，這對闡明慢重肝患者貧血機制有重要的提示意義。乙型肝炎, 尤其是慢重肝患者應注意自身免疫性溶血性貧血的可能，采取相應的治療措施。

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(本文編輯：周鵬程、陳玉華)

ClinicalsignificanceofdirectantiglobulintestinginanemiainpatientswithseverechronichepatitisB

QINWan-yuan1,MEICheng1,PENGFang1,WANGJuan1,ZHOUXiao-ying2,ZHOURong-rong1,FANXue-gong1,LINing1
(1XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China; 2AffiliatedHospitalofAerospaceMedicineInstituteofAirForceofPLA,Beijing100089,China)

ObjectiveTo evaluate clinical significance of direct antiglobulin testing(DAT) in anemia in patients with severe chronic hepatitis B(CHB).MethodsRed blood cell(RBC)-related parameters detection and DAT were performed among 30 healthy persons, 30 CHB patients, and 50 severe CHB patients, clinical factors related to positive DAT were analyzed.ResultsRBC count, hemoglobin (Hb) concentration, and hematocrit(HCT)level in severe CHB patients were all lower than CHB patients and healthy group(P<0.05)， RBC distribution width(RDW) in severe CHB patients were all higher than CHB patients and healthy group(P<0.05)；the positive rate of DAT in patients with severe CHB, CHB, and healthy group were 62.82%, 13.33% and 0 respectively. RBC count, Hb concentration, and HCT level in severe CHB patients with positive DAT were all lower than severe CHB patients with negative DAT (allP<0.05), while RDW was higher than the latter (P=0.001); after RBC was separated through capillary, positive intensity of DAT of aged RBCs was higher than young RBCs in severe CHB patients (P<0.001)；among severe CHB patients, DAT-positive and -negative patients differed in gender, age, alanine aminotransferase, total bilirubin， complement C3,C-reactive protein， and complication of diabetes(allP≤0.05).ConclusionAnemia in severe CHB patients may be related to immune hemolysis of aged RBCs induced by antibody adsorption.

hepatitis B; chronic hepatitis B; severe chronic hepatitis B; direct antiglobulin testing; red blood cell-related parameter; anemia

R512.6+2

A

1671-9638(2017)10-0904-05

2016-12-22

國家自然科學基金項目(81670538)

覃婉元(1989-)，女(壯族)，河南省鄭州市人，碩士研究生，主要從事臨床檢驗診斷學研究。

李寧 E-mail:nxli1970@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.10.003