抗生素鎖與肌注給藥在治療家兔中心靜脈導管相關感染模型中的效果差異

敖 薪, 王 娟

(1長江大學, 湖北 荊州 434023; 2 新疆醫科大學第一附屬醫院, 新疆 烏魯木齊 830054)

·論著·

抗生素鎖與肌注給藥在治療家兔中心靜脈導管相關感染模型中的效果差異

敖 薪1, 王 娟2

(1長江大學, 湖北 荊州 434023; 2 新疆醫科大學第一附屬醫院, 新疆 烏魯木齊 830054)

目的比較抗生素鎖(ALT)與全身用藥在治療中心靜脈導管相關感染中的效果差異。方法體外制作內含細菌生物膜的導管，并植入家兔中心靜脈，將其隨機分為兩組：一組為導管組，向導管內注入抗生素與肝素混合液；一組為全身組，肌內注射抗生素，導管內注入肝素液。連續用藥10 d，每日在更換藥液前留取導管血和外周靜脈血，檢測菌落數。第11天停用全部抗生素，留置導管觀察5 d再拔管。拔管前采導管血和外周血做細菌計數和藥敏試驗。并將拔出的導管做導管尖端細菌培養和生物膜觀察。結果用藥期間血培養細菌計數：不同用藥時間導管組導管血細菌平均計數均低于全身組，差異具有統計學意義(均P<0.05)；導管組外周血培養陽性標本從第4天開始逐漸出現，共有陽性標本6例；全身組陽性標本第2天即出現，共有陽性標本31例。停藥期間血培養細菌計數：兩組在拔管當日的導管血細菌計數均高于停藥當日，差異均有統計學意義(均P<0.05)。停藥當日導管組2例外周血標本檢出細菌，全身組8例陽性；拔管當日導管組無新增陽性標本，而全身組有1例新增陽性標本。全身組的導管尖端細菌計數[(8.02±0.05)log10CFU/mL]高于導管組[(3.12±0.14)log10CFU/mL]，差異有統計學意義(t=26.82，P<0.05)。導管組33.33%的標本可見散在生物膜，全身組全部標本被菌膜覆蓋。拔管前導管血和外周血細菌培養及藥敏試驗：導管組的抑菌環直徑在19～20 mm之間，全身組為15～16 mm，兩組細菌對常見抗菌藥物均為敏感。結論在治療中心靜脈導管相關感染中ALT局部清除細菌的效果優于全身用藥，可降低全身感染。但是倘若導管內細菌生物膜未完全清除，停藥后仍可復發，因此精準的用藥量和用藥時間值得進一步量化研究。

抗生素鎖; 中心靜脈導管; 導管相關感染; 細菌計數； 生物膜

[Chin J Infect Control，2017，16(10)：920-924]

中心靜脈置管不僅可以為急危重癥患者提供治療、監測和營養的途徑，還可以為化療患者提供用藥途徑，以減輕藥物刺激，還可以為透析患者建立長期的血透通道以保證透析順利進行[1]。正是這些優勢讓中心靜脈置管在臨床得以廣泛應用，而由此帶來的感染率也居高不下。據文獻報道，過去十年期間，美國599所醫院內1 623萬置管患者中有863萬例出現了導管相關菌血癥，感染發病率為53%，病死率高達35%[2]。因此，有效治療中心靜脈導管相關感染尤為重要。抗生素鎖(antibiotic lock technique，ALT)技術是由外國學者Messing在1988年率先提出，是一種將高于抗生素最低抑菌濃度的藥物溶液灌注到導管腔內，保留一定時間，達到破壞細菌生物膜結構，治療導管感染的新方法[3]。目前我國對ALT的研究還處在臨床摸索階段，文獻中盡管可以看到有學者借鑒國外的做法，在臨床上嘗試著采用該技術對中心靜脈導管相關感染進行治療，取得了較好的效果[4-5]。但是，與傳統的全身用藥相比較，其效果是否更好、療程是否更短、副作用是否更少等問題并未見報道，還有待于進一步對照研究，為此，課題組針對兩種方法的治療效果、感染復發率、細菌耐藥性等方面進行了比較研究，希望能更好地指導開展ALT技術的臨床應用。

1 材料與方法

1.1 材料 大耳白兔，體重(1.91±0.12)Kg；表皮葡萄球菌ATCC 35984；注射用頭孢他啶(1 g/瓶，上海新亞藥業有限公司，批號H10950180)；肝素(2 mL含12 500單位/支，江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，批號1405103-B)；18 G靜脈留置針(蘇州林華醫療器械有限公司)；血培養板、0.5麥氏比濁儀、快速革蘭染色液(廣東環凱微生物科技有限公司)；胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)；剛果紅培養基(CRB)；銀染試劑(天津市天力化學試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備含細菌生物膜的靜脈導管 在CRB上接種表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株，放入37℃溫箱培養24 h，看到黑色帶結晶的菌落后，將單個菌落加于5 mL 0.9%氯化鈉溶液中，對照比濁儀調試至0.5麥氏單位[約(1～2)×108CFU/mL][6]。用無菌試管將10 mL TSB培養基和108CFU/mL的菌液l00 mL混合搖勻，取適量的菌懸液注入18 G靜脈留置針管腔，不發生外漏，用碘伏消毒管腔外壁，溫箱內連續培養3 d[7]。取出留置針，用無菌生理鹽水漂洗，去除浮游菌。隨機選取其中1支留置針，進行銀染處理，并在光學顯微鏡下觀察，若鏡下可見黑色絮狀物，提示導管內細菌生物膜形成[8]。

1.2.2 植入導管 靜脈麻醉大耳白兔，手術區域備皮并碘伏消毒，鋪巾戴手套，在頸外側做切口，暴露頸外靜脈并鈍性分離，然后在頸外靜脈的下方引入兩根縫合線，分別放在靜脈的遠心端和近心端，同時結扎遠心端，近心端縫線打活結備用。夾閉近心端，再次用碘伏消毒留置針外部，并將留置針管腔部分全部植入靜脈內，開放近心端，用備用縫線將留置針管腔與靜脈一起結扎固定。然后接好肝素帽并沖凈回血，最后做頸部切口縫合，貼好無菌透明敷貼，用無菌繃帶饒頸做環形包扎。如圖1所示。

圖1 大耳白兔經頸外靜脈導管植入圖

1.2.3 分組 將置管白兔隨機分為兩組，每組9只。一組為導管組，在導管內注入頭孢他啶-肝素混合液0.3 mL，濃度為900倍最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，即7.2 mg/mL(頭孢他啶1 000 mg加生理鹽水138 mL加肝素1 mL)；另一組為全身組，在家兔大腿根部肌內注射頭孢他啶，一日劑量為100 mg/kg×體重，分兩次注入。同時向管腔注入無菌肝素生理鹽水0.3 mL(125 UI/mL)。兩組均每24 h更換導管液一次，在更換導管液之前，先抽出導管內原有的液體。連續用藥10 d，每日在更換導管液前留取導管血和外周靜脈血，用稀釋平板計數法檢測菌落數，計數>5 log10CFU/mL記為陽性。第11天停止使用全部抗生素，但仍然留置導管觀察5 d，第6天拔出導管。拔管前采集導管血和外周血做菌落計數和藥敏試驗(紙片擴散法)。并將拔出的導管剪下前端2 cm，其中1 cm 進行細菌培養、菌落計數，1 cm進行銀染，并觀察生物膜清除程度。

1.2.4 統計學方法 應用軟件SPSS 17.0進行統計分析，資料均為計量資料，兩組標本血細菌計數的比較采用t檢驗，P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 用藥期間血培養細菌計數 導管血細菌計數：不同用藥時間導管組導管血細菌平均計數均低于全身組(均P<0.001)，見表1。其中導管組有66.70%的標本細菌計數為0，而全身組無細菌計數為0的標本。外周血細菌計數：導管組外周血培養陽性標本從第4天開始逐漸出現，第4、6天各有陽性標本1例，第8、10天各有陽性標本2例；全身組陽性標本第2天即出現，第2、4、6天分別有陽性標本3、5、7例，第8、10天各有8例，共31例。

表1 兩組導管血細菌平均計數比較

2.2 停藥期間血培養細菌計數 停藥當日和拔管當日的導管血細菌平均計數：導管組分別為(1.08±0.11)、(3.14±0.13)log10CFU/mL；全身組分別為(6.34±0.08)、(7.92±0.13)log10CFU/mL；兩組在拔管當日的導管血細菌計數均高于停藥當日，差異均有統計學意義(t值分別為2.80、365.94，均P<0.05)。導管組停藥當日導管血中未檢出細菌的置管白兔，拔管當日導管血中仍未檢出。全身組停藥當日導管血中均檢出細菌，且拔管當日所有導管血細菌計數均為8 log10CFU/mL左右。外周血細菌計數：停藥當日導管組2例外周血標本檢出細菌，全身組8例陽性；拔管當日導管組無新增陽性標本，而全身組有1例新增陽性標本，發生在停藥時導管細菌計數為0～5 log10CFU/mL的白兔中。

2.3 導管尖端檢測結果 導管尖端細菌計數與拔管當日導管血細菌計數結果趨于一致，導管組均值為(3.12±0.14)log10CFU/mL，全身組均值為(8.02±0.05)log10CFU/mL，全身組高于導管組(t=26.82，P<0.05)。導管腔銀染：導管組66.67%的標本銀染后未見細菌膜結構，結果呈陰性，33.33%的標本可見少量斑塊和散在成團的絮狀物，但尚未連接成片。全身組導管尖端標本均呈現黑色相連的絮狀物，管腔底部被菌膜覆蓋。

2.4 藥敏試驗結果 導管組的抑菌環直徑在19～20 mm之間，全身組為15～16 mm，依據藥敏判斷標準，兩組細菌對常見抗菌藥物均為敏感。

3 討論

研究結果表明ALT技術與傳統的全身給藥相比，抗菌療效更強。導管感染與細菌生物膜的形成有不可分割的關系[9]。據報道，表皮葡萄球菌是引起血管導管相關感染的常見病原菌之一，一旦感染極易形成生物膜[10]。細菌生物膜的形成是細菌為適應不利于生長的環境而采取的一種生存策略，生物膜是細菌分泌產生的胞外多糖聚合物相互黏連形成的細菌群落的膜狀物，其主要成分包括多糖、纖維蛋白、纖連蛋白以及層黏連蛋白[11]。它具有很強的黏附力，可黏附于活體表面或者醫用材料表面，如導管、人工瓣膜、人工關節和起搏器等物體表面[12]。導管中細菌生物膜一旦形成，不僅可以介導病原菌黏附和定植，使定植后的細菌遷移、擴散，隨血液進入循環，引起菌血癥或血流感染。還可以使隱藏其中的病原菌獲得抵御機體免疫防御機制和抗生素攻擊的能力[13-14]。研究報道形成了生物膜的細菌對抗生素的抵抗力比游離的未形成生物膜的細菌高100～1 000倍[15]。正是這種對抗生素有極強耐藥性的特點使細菌生物膜難以清除，導致感染持續存在，給臨床治療帶來嚴峻困難[16]。ALT是將高于100～1 000 倍MIC的抗生素溶液填充在導管內而不是被機體吸收利用，因此，又叫做“LOCK”[17]。目的是利用高濃度抗生素溶液與導管內細菌生物膜直接、持續接觸，使藥物有機會滲入到膜實質中直至破壞其有效結構，從而有效清除生物膜和膜內細菌，增強和提高抗生素殺菌能力[18]。正因如此，本次研究在用藥期間，導管組檢測導管血時超過60%以上的標本未檢測出細菌，且拔管后取其導管尖端，做管腔銀染處理，結果也未見生物膜形成。因此，ALT與肌注抗生素相比較，抗菌效果更好，全身感染出現時間更晚、發生概率更小；相反，全身使用抗生素其濃度在到達導管局部時會明顯降低，不能有效滲透到定植在導管表面的細菌生物膜實質中，既不能破壞細菌生物膜，也不能鏟除嵌在膜內的細菌，使感染難以控制。研究中全身組的導管血培養均檢出細菌，導管尖端管腔銀染也均為陽性，且有生物膜。隨著全身用藥時間延長，細菌對抗生素的敏感性逐漸下降，繼而對導管局部細菌的殺滅作用逐漸減弱。

停藥期間導管血和外周血培養結果表明，全身組拔管當日導管血細菌計數均較停藥當日增加，外周血培養結果中全身組在拔管當日有1例新增陽性病例。兩組均存在感染復發，原因可能為：(1)本次研究在制作生物膜時，不排除有菌懸液未充分混勻，或漂洗不充分，使少數導管中形成的生物膜厚實、穩固，需要更高濃度的抗生素和更長時間才能徹底清除，超越了本次研究設計的用藥濃度和時間。(2)抗生素只殺死了細菌生物膜表面的細菌，而生物膜并未完全鏟除，殘留在生物膜中的細菌繼續繁殖，并不斷釋放浮游菌進入血液[19]，致使全身感染復發。由于全身組的抗菌效果較導管組差，殘留在導管內的細菌和生物膜遠多于導管組，釋放的浮游菌更多，繼而停藥后，全身組不僅導管血菌落數增加，還新增1例全身感染病例。而導管組雖然導管血的菌落數也在增加，也會釋放浮游菌，但并未達到使外周血呈陽性的程度，故未發生全身感染。因此，臨床使用ALT技術時，有必要定期監測導管血菌落數，判斷細菌生物膜清除情況，評估ALT使用效果，在導管血培養陰性的情況下，才可停止用藥。(3)每日進行導管注藥或肝素封管時，均有可能會使管腔中少量的浮游細菌隨藥液一起進入循環系統中，導致菌血癥。此時即使導管內的細菌生物膜已經清除，在停用抗生素后，循環當中的細菌還會沿導管重新定植在導管腔內，再次形成細菌生物膜，引起感染復發。建議使用ALT技術時，合理控制注藥量，最好不超過導管容量；注藥速度慢、力量小；注藥前需及時去掉導管中的原藥液和前段血液，避免將導管內游離細菌帶入血液；還可以考慮在導管注藥同時配合全身用藥。

研究結果表明兩組用藥方法均未產生耐藥，其中導管組抑菌環直徑大于全身組。細菌耐藥性的產生有4條路徑[20]：(1)細菌染色體耐藥基因發生突變，改變或修飾了藥物作用的靶位，使藥物難以發揮作用。(2)細菌可合成一種使藥物失活的鈍化酶，讓抗生素失去活性，以阻擋抗菌藥物向靶細胞穿透。根據報道，臨床上有許多抗生素屬于β-內酰胺類抗生素，它的化學結構中具有β-內酰胺環，頭孢菌素就是其中一種。表皮葡萄球菌可產生類似的β-內酰胺酶[21]，并借助酶分子中的絲氨酸活性位點，與抗生素的β-內酰胺環結合，打開此環，致藥物失靈。(3)細菌啟動外排系統，把藥物泵出細胞外，阻止藥物入侵。(4)形成新的代謝途徑代替被藥物阻斷的代謝途徑，使藥物失去作用。然而，無論通過哪條途徑均需足夠時間才能改變。通常情況下使用抗生素2周內，不易產生耐藥性[22]。由于本次實驗是按照臨床常規使用抗生素的時間設計的研究周期，用藥時間短，細菌尚未對逃脫抗生素這一危機做出改變。所以此次實驗并未發生細菌耐藥。從抗生素自身分析，由于本次研究選擇的頭孢他啶對β-內酰胺酶具有高度的穩定性，表皮葡萄球菌產生的β-內酰胺酶無法打開其β-內酰胺環，因此，不易產生耐藥[23]。導管內使用抗生素可直接作用于細菌，使其迅速死亡，來不及發生耐藥基因突變，更不會產生新的多肽類物質，也無法啟動外排系統，徹底切斷了細菌產生耐藥的路徑；相反，全身用藥時局部滅菌作用弱，滅菌所需要的時間長，給細菌產生耐藥提供了充足的時間和機會，產生耐藥的可能性將增大。

ALT技術的不足之處：雖然ALT技術是一種新的治療中心靜脈導管相關感染的有效方法，但由于治療期間導管被抗生素溶液鎖住，需要停止導管的使用，期間不能正常發揮導管的作用。

綜上所述，ALT技術是治療中心靜脈導管相關感染的有效方法，與全身使用抗生素相比，殺滅細菌的作用更強，效果更迅速，引發全身感染的概率更小。但是，在導管內細菌及生物膜沒有完全清除的情況下，停止用藥會出現復發。因此，如何精準把握有效的用藥量和徹底清除生物膜的用藥時間，值得今后進一步研究。

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(本文編輯：陳玉華)

Differenceinefficacybetweenantibioticlocktechniqueandintramuscularinjectionforthetreatmentcentralvenouscatheter-relatedinfectioninrabbitmodel

AOXin1,WANGJuan2
(1YangtzeUniversity，Jingzhou434023,China；2TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ObjectiveTo compare the efficacy of antibiotic lock technique (ALT) and systemic medication on the treatment of central venous catheter-related infection(CRI).MethodsCatheters which had been formed bacterial biofilm in vitro were implanted into the central venous of rabbits, and rabbits were randomly divided into two groups, catheter group received the injection of mixture of antibiotics and heparin， systemic group received intramuscular injection of antibiotics and intraductal injection of heparin solution. Medicine was given continuously for 10 days, catheter blood and peripheral venous blood were taken every day before replacing the medicine, bacterial colony counts were detected. All rabbits stopped using antibiotics on day 11, then removed catheters after a 5-day observation of catheterization. Before extubation, the catheter blood and peripheral blood were collected to perform bacterial colony counting and antimicrobial susceptibility testing， and removed catheters were performed catheter tip bacterial culture and observation of biofilm.ResultsDuring the medication period, the average bacterial counts of catheter blood in catheter group at different time were all lower than systemic group, difference was statistically significant(allP<0.05)；from the 4th day, the catheter group gradually appeared positive specimens of peripheral blood culture(a total of 6 cases), and systemic group appeared positive specimens on the second day(a total of 31 cases). During medicine withdrawal period, bacterial counts of catheter blood in two groups on the day of extubation were both higher than those on the day of medicine withdrawal, differences were both statistically significant(bothP<0.05). On the day of medicine withdrawl, 2 cases in catheter group and 8 cases in systemic group were isolated bacteria from peripheral blood; there was no new positive specimens in catheter group on the day of extubation, but there was 1 new positive specimen in systemic group. Catheter tip bacterial count in systemic group was higher than catheter group ([8.02±0.05] log10CFU/mL vs [3.12±0.14]log10CFU/mL,t=26.82，P<0.05). 33.33% of specimens in catheter group could be observed scattered biofilm, while all specimens of systemtic group were covered by biofilm. Bacterial culture and antimicrobial susceptibility testing of catheter blood and peripheral blood before extubation revealed that diameter of the zone of inhibition in catheter group ranged 19-20 mm, in systemic group ranged 15-16 mm, bacteria from two groups were all sensitive to commonly used antimicrobial agents.ConclusionIn the treatment of central venous CRI, the effect of ALT on local clearance of bacteria is better than that of systemic administration, and it can significantly reduce systemic infection. However, if bacterial biofilm in the catheter is not completely cleared, infection can still relapse after medicine withdrawal. Therefore, accurate dosage and medication time is worthy of further quantitative study.

antibiotic lock technique； central venous catheter； catheter-related infection; bacteria count; biofilm

R978.1

A

1671-9638(2017)10-0920-05

2016-11-04

湖北省衛生和計劃生育委員會基金項目(WJ2015HB036)

敖薪(1961-)，女(漢族)，湖北省荊州市人，教授，主要從事急危重癥救治研究。

王娟 E-mail:540504035@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.10.006