植物根部內生細菌多樣性及其生防作用研究進展

曹焜+王曉楠+孫宇峰+李振偉+潘冬梅+趙越

摘 要：植物內生細菌廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實、種子等組織器官中，研究植物內生細菌多樣性在物種資源開發與利用等方面具有重要意義，近年來內生細菌的作用逐漸受到科研工作者的重視。本文針對植物根部內生細菌多樣性、定殖過程及其生防作用等幾方面進行綜述，旨在深入了解植物根部內生細菌資源，為植物內生菌資源開發利用提供參考。

關鍵詞：根；內生細菌；多樣性；定殖；生防作用

中圖分類號：S182 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170931001

植物內生菌（endophyte）指能夠在健康植物活組織中生存而不引起寄主植物明顯病變的一大類微生物，是一個生態學概念，主要包括細菌、真菌和放線菌[1]。其中，內生細菌（endophytic bacteria）是內生菌的重要組成部分，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實、種子等組織中[1-3]，而根部的內生細菌數量遠超過其他組織。研究發現內生細菌具有固氮、促進植物生長、增強植物抗性、生物防治[4-6]等方面的作用。隨著農業耕作模式的改革、有機食品需求量增大、人們環保意識的增強，化肥農藥減量的同時，生物防治的優勢也不斷突顯出來。目前，王志偉等[7]已從宏觀角度對植物內生菌研究的發展及其意義進行總結分析，也有內生菌多樣性、內生菌生防作用[8，9]等方面的專題報道，而本文更加細化地從植物根部內生細菌多樣性及其生物防治作用2方面進行綜述分析，為深入了解內生細菌和生防微生物提供理論參考

1 植物根部內生細菌多樣性

植物體內存在大量微生物，其中很大一部分為內生細菌。為此，研究內生細菌多樣性不僅可以解析植物內生細菌群落結構、變化規律，還能為功能菌株篩選和鑒定提供理論依據。隨著分子生物學技術發展，很大程度上提高微生物檢測方法的靈敏度，使得多樣性研究成為內生細菌研究的重要組成部分。

內生細菌多樣性不僅表現在寄主植物多樣性上，還體現在內生細菌種類多樣性方面。目前已從水稻[2]、小麥[10]、甜菜[11]等不同植物根組織中發現多種內生細菌，對比發現不同寄主類型和寄主生長環境是影響內生細菌多樣性的2個因素。在甜菜生長的幼苗期、葉叢快速生長期、塊根增長期和糖分積累期時，根部內生細菌的類群數目分別為66 OTUs、109 OTUs、146 OTUs和95 OTUs[11]，可見在相同環境下生長的同種植物根部，內生細菌的多樣性也會隨寄主生長階段的變化而變化。

研究植物根部內生細菌多樣性常采用2種方法，分別為培養法和非培養的分子生物學方法。培養法通過選擇不同培養基和培養條件篩選出相應的目的微生物，張瑞杰等[12]通過分離純化法研究香蒲根內生細菌多樣性，發現優勢菌屬是假單胞菌屬（Pseudomonas）和拉恩氏菌屬（Rahnella）。由于培養法僅能獲得環境中1 %～10 %的微生物[13]，即培養法會人為降低植物根部內生細菌多樣性。因此，需要結合非培養的分子生物學方法進行研究才能獲得更大的突破。Zhang等[14]用T-RFLP和克隆文庫技術發現α-變形菌和β-變形菌是大豆根部的優勢內生細菌類群，同時也發現一些未知細菌類群。盡管經典的DGGE、T-RFLP和克隆文庫等非培養法能用于分析內生細菌多樣性和相對豐度，但受其分辨率的制約[15]，一些微量及痕量內生細菌很難被發現。隨著測序技術的發展，一些高準確性、高通量、高靈敏度的檢測技術被應用在內生細菌多樣性檢測中。Yu等[16]采用LNA-PCR和454高通量測序方法發現假單胞菌屬（Pseudomonas）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和黃桿菌屬（Flavobacterium）是大豆內生細菌的主要成員，同時還發現一些數目較少的不可培養內生細菌，進一步說明大豆根內生細菌多樣性豐富。

2 植物根內生細菌的定殖

許多細菌不僅存在土壤中，也定殖在植物根部，特定的選擇機制使得他們向根際移動并定殖于適宜的植物根部，因此認為根際土壤是植物內生細菌的主要來源[17]。根際土壤中潛在內生菌先吸附在根組織表面[18]，通過自然孔口和傷口等多種孔洞進入根部[17]，通常定殖于木質部導管和細胞間隙中[18]。科研工作者們通過抗生素標記法、免疫學方法、基因標記法以及同位素示蹤、組織染色等方法檢測內生細菌的定殖過程。其中綠色熒光蛋白（GFP）標記技術以其性能穩定、表達與受體細胞無關、方便檢測等優點被許多研究者所采用[19]。郝慧娟等[19]采用GFP法研究枯草芽孢桿菌BSD-2在黃瓜植株內定殖及傳導過程，認為枯草芽孢桿菌通過占據有利的生態位而阻止病原菌的進入，從而防止病害的發生。明確內生細菌侵染定殖規律對于相關菌劑的開發與應用是至關重要的，同時也能從分子和細胞水平闡述內生細菌與寄主植物間的互作關系。

3 植物根部內生細菌生物防治作用

生物防治就是利用某種生物或其產物抑制有害生物的方法。其中利用有益微生物，通過生物間競爭作用、拮抗作用、寄生作用、溶菌作用及誘導抗性等，來抑制某些病原物的方法是微生物防治。筆者認為微生物防治主要可以分為“菌-病”和“寄主-病”2個方面。

所謂“菌-病”就是指利用有益微生物通過競爭、抗生、寄生、溶菌等作用去抑制或殺死某些病原物的方式。如表1中的芽孢桿菌，不僅能產β-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶、幾丁質酶等分解酶去降解病害真菌的細胞壁；同時還能產生嗜鐵素，競爭性抑制病原菌吸收鐵元素，從而達到抑制病原菌生長的目的[20]。隨著研究的深入，Xu等[21]通過反轉錄技術、ptsI載體構建和基因敲除法對蠟樣芽胞桿菌進行研究，發現ptsI基因能促進蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus strain 0–9）的生物膜形成，增加其在小麥根際的生存和定殖能力，最終促進其對紋枯病菌的抑制作用；同時也證明野生型蠟樣芽胞桿菌0–9是防治小麥紋枯病的理想生防菌。因為Xu等[21]的試驗是在實驗室條件下進行的，所以還需在盆栽或大田條件下對野生型蠟樣芽胞桿菌0–9的生防能力進一步的檢測分析。目前，生防菌通過產生抗菌素、蛋白酶、纖維素酶、嗜鐵素等物質在抑制葡萄霜霉病、梨樹腐爛病、煙草黑脛病等[22]方面取得一定突破。但防效單一、需菌量大、環境依賴強等缺點也制約著微生物防治的發展。endprint

而“寄主-病”是指拮抗微生物誘發植物自身抗病機制從而增強植物的抗病能力。如表1中沙雷氏菌[24]，能誘導黃瓜產生系統抗性（induced systemic resistance， ISR）抵抗黃瓜炭疽菌、腐敗病等病害。自從Chester[25]于1933年首次報道誘導植物產生免疫力后，ISR作為植物保護的一種新機制逐漸引起人們重視。到目前為止，已有許多植物免疫誘抗劑方面的報道[26]。

4 展望

利用細菌16s rDNA及一些功能基因作為分子標記對植物根部內生菌多樣性研究取得一定進展。通過對比發現：16S rDNA是一段耐受環境脅迫的保守序列，一般可鑒定到亞屬或屬以上的分類單位。通過對16S rDNA的序列對比分析，基本上可以分析出植物根部內生細菌的豐度。若要進一步分析某個屬內的細菌組成，則需要結合該屬細菌的特異性功能基因[28]。

大量研究發現，不同內生細菌在植物根部的定殖規律各不相同，同時也說明內生細菌在定殖能力、分布位點和定殖數量等方面均有較大差異。也有人將內生細菌與病原菌結合研究，發現他們之間具有很多相似之處，為更加合理利用內生細菌的生防功效提供理論途徑。但上述研究大多集中在內生細菌的定殖過程及后續的傳導途徑部分，尚未對其在寄主體內的傳導機制、增殖的影響因素及防病機理等部分做深入研究。

與其他土壤微生物相比，內生細菌長期生活在植物體內，使得其具有更多的生態優勢和適應能力[29]。但內生細菌的生物防治過程十分復雜，受病害類型、自然環境、植物種類等多種因素影響。目前，關于生防菌制劑防效差、用量大、用法復雜等問題大量出現。因此，需要在內生細菌定殖、生防能力評價、與寄主關系等方面進行研究；在篩選生防菌時，應當以多種病原菌作為篩選條件，篩選出高效、穩定、易推廣的菌株，并將多種菌劑合理的復配使用，來提高內生細菌的綜合防效；同時還應結合盆栽及田間試驗進行驗證，為生防微生物制劑的開發與推廣奠定基礎。

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作者簡介：曹焜，黑龍江鶴崗人，碩士，研究實習員，研究方向為漢麻育種及漢麻內生菌；王曉楠，黑龍江綏化人，博士，副研究員，研究方向為漢麻育種及組學研究。endprint