厭氧技術(shù)在專性兼性和微需氧厭氧菌中的應(yīng)用

沈泓+黃建鋒+錢朝峰

摘 要：厭氧菌在基礎(chǔ)微生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、食品與發(fā)酵等方面的作用與研究日益受到重視，培養(yǎng)厭氧菌的方法很多。本文比較了智能厭氧系統(tǒng)與厭氧盒法、燭缸法、厭氧培養(yǎng)箱法的實(shí)際使用效果。為相關(guān)產(chǎn)品的監(jiān)督管理提供科學(xué)的技術(shù)支撐和詳盡的參考資料。

關(guān)鍵詞：厭氧菌；微需氧；智能厭氧系統(tǒng)；評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：S852.61+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170931007

引言

厭氧菌是一類只能在低氧分壓的條件下生長(zhǎng)，而不能在空氣（18%氧氣）和（或）10%二氧化碳濃度下的固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的細(xì)菌。按其對(duì)氧的耐受程度的不同，可分為專性厭氧菌、微需氧厭氧菌和兼性厭氧菌。它是自然界中分布廣泛、性能獨(dú)特的一類微生物，近年來(lái)在基礎(chǔ)微生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、食品與發(fā)酵等方面的作用與研究也日益受到重視。培養(yǎng)厭氧菌的方法很多，其中應(yīng)用較廣泛且有成效的有厭氧盒法、燭缸法、厭氧培養(yǎng)箱法、智能厭氧系統(tǒng)法等。

相比傳統(tǒng)厭氧培養(yǎng)方法，智能厭氧系統(tǒng)有許多優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，系統(tǒng)自動(dòng)運(yùn)行厭氧；可隨意設(shè)定培養(yǎng)環(huán)境的氣體比例——氧氣、CO2、氫氣、氮?dú)猓豢煽焖龠_(dá)到培養(yǎng)條件：微需氧、CO2：2min；厭氧：小于10min；氣體消耗量小；不產(chǎn)生化學(xué)廢棄物；催化氫氣將替換法殘存的0.16%的氧氣徹底消耗，可無(wú)限次再生等外部?jī)?yōu)勢(shì)。

智能厭氧系統(tǒng)的罐體都是采用透明的聚碳酸酯硬質(zhì)塑料制成的圓筒形罐體，在蓋的下方中央，旋連著一個(gè)金屬絲網(wǎng)盒，用于存放活化的鈀條。達(dá)到無(wú)氧狀態(tài)的方法是用抽氣換氣法以氮或二氧化碳驅(qū)除罐內(nèi)氧氣，并利用含鈀的常溫催化劑是氫與氧發(fā)生“燃燒”以達(dá)到除氧。

本實(shí)驗(yàn)以 GB 4789.35-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》及GB/T 4789.13-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》為基礎(chǔ)，比較了智能厭氧系統(tǒng)與厭氧盒法、燭缸法、厭氧培養(yǎng)箱法的實(shí)際使用效果。為相關(guān)產(chǎn)品的監(jiān)督管理提供科學(xué)的技術(shù)支撐和詳盡的參考資料。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

隨機(jī)購(gòu)買12種不同種類或品牌的發(fā)酵乳1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#、11#、12#，MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基，自制產(chǎn)氣莢膜梭菌菌懸液13#、14#、15#、16#、17#，0.1%蛋白胨水，亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS），滅菌生理鹽水，除氧袋，厭氧盒，移液器，漩渦震蕩儀，智能厭氧系統(tǒng)，BINDER培養(yǎng)箱，厭氧培養(yǎng)箱，玻璃干燥器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 智能厭氧系統(tǒng)法

將平皿放入專用罐中，放入鈀片并密封，接入智能厭氧系統(tǒng)，在程序面板上按“厭氧”按鈕，厭氧操作自動(dòng)運(yùn)行，完畢后放入36℃±1℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)48h±2h后觀察乳酸菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落并計(jì)數(shù)。同一樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

1.2.2 厭氧盒法

將平皿放入?yún)捬鹾兄校湃氤醮爸甘緞w上厭氧盒蓋并密封。放入36℃±1℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)48h±2h后觀察乳酸菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落并計(jì)數(shù)。同一樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

1.2.3 燭缸法

將平皿放在玻璃干燥器中，點(diǎn)燃蠟燭，玻璃蓋邊沿涂凡士林后，密封。完畢后放入36℃±1℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)48h±2h后觀察乳酸菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落并計(jì)數(shù)。同一樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

1.2.4 厭氧培養(yǎng)箱法

操作室厭氧環(huán)境形成，菌種的置入，調(diào)節(jié)溫度至36℃，培養(yǎng)48h±2h后觀察乳酸菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落并計(jì)數(shù)。同一樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

1.2.5 結(jié)果報(bào)告

乳酸菌CFU/g；產(chǎn)氣莢膜梭菌CFU/g。

1.2.6 誤差率

誤差率（%） =（智能厭氧系統(tǒng)法組-另一組）×100/（二組平均菌數(shù)）。

2 結(jié)果

2.1 菌落外觀

36℃±1℃中培養(yǎng)48h±2h后，12組樣品分別觀察乳酸菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，厭氧系統(tǒng)法、厭氧盒法、厭氧培養(yǎng)箱法培養(yǎng)的菌落外觀形狀與大小無(wú)明顯區(qū)別，燭缸法的菌落相對(duì)較小。

2.2 乳酸菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌計(jì)數(shù)

從表1可以看出36℃±1℃中培養(yǎng)48h±2h后，厭氧盒法、厭氧培養(yǎng)箱法與智能厭氧系統(tǒng)法培養(yǎng)的乳酸菌數(shù)同一樣品間誤差率均<±15%，屬于正常的微生物菌落個(gè)數(shù)波動(dòng)范圍。而燭缸法與智能厭氧系統(tǒng)法培養(yǎng)乳酸菌結(jié)果差異較大，誤差率均>15%。

由于產(chǎn)氣莢膜梭菌比乳酸菌對(duì)厭氧的要求更高，所以，在表2中，厭氧盒法與智能厭氧系統(tǒng)法相比，有一組數(shù)據(jù)超出>15%，厭氧效果稍差；燭缸法與智能厭氧系統(tǒng)法培養(yǎng)結(jié)果差異較大。而厭氧培養(yǎng)箱法與智能厭氧系統(tǒng)法培養(yǎng)的乳酸菌數(shù)同一樣品間誤差率均<±15%，屬于正常的微生物菌落個(gè)數(shù)波動(dòng)范圍。

2.3 綜合比較各厭氧培養(yǎng)方法

厭氧菌培養(yǎng)以智能厭氧系統(tǒng)最為方便實(shí)用，它的主要特點(diǎn)是輕便、簡(jiǎn)單，操作方便，培養(yǎng)專性厭氧菌、微需氧厭氧菌和兼性厭氧菌效果都很好。

參考文獻(xiàn)

[1]張軍民，周貴民.厭氧菌血培養(yǎng)仍是值得重視的問(wèn)題[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28（10）：979-980.

[2]Wilson JR，Limaye AP. Anaerobic bacteremia： the yield of positive anaerobic blood [2]cultures ： patient characteristics and po ent al risk factors[J]. Clin Chem Lab Med，2003，41（3）：293-297.

[3]Zahar JR，F(xiàn)arh at H，Chachart y E，et al . Incidence and clinical significance of anaerobic bacteraemia in cancerpatient s： a 6 year retrospective study[J].Clin Microbiol Infect，2005，11（9）：724-729.

[4]全國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)崗位培訓(xùn)園地. 微生物檢驗(yàn)輔導(dǎo)綱要[J]. 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1992，15（2）：116.

[5]吳多榮，張淑芳，張冬霞，等.厭氧菌感染與臨床檢驗(yàn)[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2005，5（2）：284-285.endprint