去水淫羊藿素對大鼠視網膜缺血/再灌注損傷的保護作用

呂昊琴，吳維霖，劉艷芳，劉錦榮，劉星芳，謝佳麗，黃志華，王輝

(1.贛南醫學院研究生學院，江西贛州341000；2.贛南醫學院生理學教研室，江西贛州341000；3.贛南醫學院第一附屬醫院眼科，江西贛州341000)

去水淫羊藿素對大鼠視網膜缺血/再灌注損傷的保護作用

呂昊琴1，吳維霖1，劉艷芳3，劉錦榮1，劉星芳1，謝佳麗1，黃志華2，王輝3

(1.贛南醫學院研究生學院，江西贛州341000；2.贛南醫學院生理學教研室，江西贛州341000；3.贛南醫學院第一附屬醫院眼科，江西贛州341000)

目的研究去水淫羊藿素(ICT)對大鼠視網膜缺血/再灌注損傷是否具有保護作用，并初步探討其作用機制。方法將40只SD大鼠采取隨機數表法分為5組(n=8)，通過夾閉一側頸總動脈的方法構建大鼠視網膜缺血/再灌注(I/R)模型。分別于夾閉前，一次性經腹腔注射不同劑量(1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg)ICT；假手術組及模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射；假手術組只分離不夾閉，模型組與藥物組建立視網膜I/R模型。各組分別在夾閉前、缺血30 min時行視網膜電流圖(ERG)、眼底照相檢查以及再灌注1 h后行ERG、眼底熒光血管造影(FFA)檢查。再灌注6 h后獲取視網膜，通過免疫印跡法檢測白介素10(IL-10)蛋白表達水平。結果與模型組比較，ICT治療組能顯著改善ERG的a波、b波振幅降低，使后極部視網膜缺血動脈明顯擴張，并且能升高視網膜I/R損傷后視網膜組織IL-10蛋白表達水平[(1.02±0.44)vs(0.47±0.21)]，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論ICT對視網膜缺血/再灌注損傷具有保護作用，其保護機制可能與上調抗炎細胞因子IL-10蛋白表達水平，抑制炎癥反應有關。

去水淫羊藿素；視網膜；缺血再灌注損傷；IL-10；電流圖

視網膜缺血性眼病是臨床上常見的一種致盲性眼病，缺血-再灌注視網膜損傷(retinal ischemia reperfusion injury，RIRI)是其治療過程中常發生的病理過程，主要表現為缺血視網膜恢復血液供應后，患者視力未見改善反而視網膜出現明顯功能障礙。目前，關于視網膜缺血/再灌注損傷的確切發病機制尚未完全清楚。有研究發現，再灌注最早表現為缺血區白細胞堆積和炎性細胞因子增多，可見炎癥反應在缺血/再灌注視網膜損傷的發病機理中發揮著重要作用。去水淫羊藿素(icaritin，ICT)是巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿等干燥莖和葉的水提取物。國內外有學者研究發現，ICT具有抗腫瘤[1]、抑制骨質疏松[2]、抗纖維化[3]等藥理活性。此外，本課題組前期研究結果表明，ICT具有中樞抑制[4]、耐缺氧[5]、鎮痛[6]以及保護腦缺血再灌注損傷作用[7]。本實驗通過建立視網膜I/R損傷模型，研究去水淫羊藿素對視網膜缺血再灌注損傷是否有保護作用，并探討其保護作用與IL-10的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物去水淫羊藿黃素(C21H20O6)為黃色結晶粉末，分子量為368.38，由(上海)天習化工有限公司提供，純度99%以上，實驗前采用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)及超純水溶解至所需濃度。DMSO購自Sigma公司(貨號：D2650)，IL-10抗體購自Santa Cruz公司(貨號：SC-365858)，超強信號west pico stable peroxide solution(Thermo公司，貨號：1862419)，超強信號west pico luminal/enhancer solution(Thermo公司，貨號：1862418)，Western bloting luminal reagent(Santa cruze，貨號：Sc-2048)，BCA蛋白定量試劑盒(北京，天根生化科技有限公司，貨號：P4715/P4321)，美多麗滴眼液(日本，參天制藥株式會社)，熒光素鈉注射液(中國，愛爾康眼科產品有限公司)，水合氯醛(國藥集團上?；瘜W試劑有限公司)，乙醇、液氮、生理鹽水、SDS-PAGE電泳液、1×轉膜液(贛南醫學院科研中心)。

1.2 實驗動物40只SPF級SD雄性大鼠，體質量為(300±25)g，購自贛南醫學院動物實驗中心，動物中心許可證號：SCXK(贛)2014-0001。飼養條件：SPF級動物房，12 h光照/12 h黑暗的自然晝夜光線照明，室內通風良好，室溫恒定在(25±2)℃，標準顆粒飼料，自由飲水和攝食，適應性飼養5～7 d后開始實驗。

1.3 所用儀器RetiMNER-S視覺電生理儀(重慶艾爾曦醫療設備有限公司)，CF-60UD眼底照相及眼底血管熒光造影儀(日本，科林，佳能)，Universal HoodⅡ型超靈敏度化學發光成像系統(美國，Bio-Rad公司)，多功能酶標儀-3001型(美國，Thermo公司)。

1.4 實驗方法[8-10]

1.4.1 分組與構建視網膜I/R模型SPF級SD雄性大鼠40只，采用隨機數表法將其分為5組(n=8)，即假手術組、視網膜I/R模型組(簡稱模型組)、I/R+低劑量(1.0 mg/kg)ICT治療組、I/R+中劑量(2.0 mg/kg)ICT治療組及I/R+高劑量(4.0 mg/kg)ICT治療組。采用體積分數為10%的水合氯醛(按350 mg/kg)經腹腔注射將老鼠麻醉，固定于動物解剖板上，用75%乙醇消毒頸部皮膚，于頸部正中線切開大鼠皮膚，用止血鉗將皮下組織逐層進行鈍性分離，暴露出右側頸總動脈，動脈夾夾閉右側頸總動脈，60 min后松開動脈夾，縫合皮下組織及皮膚，構建大鼠視網膜I/R模型。假手術組僅分離出頸總動脈，不進行夾閉。術中嚴格控制室溫在23℃～25℃。藥物組和對照組在夾閉頸總動脈前分別經腹腔注射1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg的ICT和等體積的生理鹽水。

1.4.2 ICT對視網膜缺血/再灌注損傷的影響麻醉大鼠后，用美多麗滴眼液散瞳，將大鼠固定在動物解剖板上，分別在夾閉大鼠頸總動脈前和缺血30 min時行視網膜電流圖(ERG)和眼底照相及眼底熒光血管造影(FFA)檢查；再灌注1 h后分別行ERG和FFA檢查。

1.4.3 視網膜IL-10蛋白表達水平檢測再灌注6 h后，用大劑量麻藥麻醉大鼠(方法同1.4.1)致死，迅速摘下眼球，置于冰浴中，依次去除角膜、虹膜、晶狀體及玻璃體，獲取視網膜后迅速放入液氮罐中，后置于-80℃冰箱保存。提取組織蛋白后采用BCA蛋白定量試劑盒，按試劑盒說明書嚴格進行操作，蛋白定量完畢后，采用Western blot法檢測視網膜組織IL-10的表達水平。根據所測蛋白分子量大小制備12%的SDS-PAGE分離膠和5%的濃縮膠進行蛋白電泳后，嚴格按照濕法轉膜的步驟進行轉膜，轉膜完畢后將硝酸纖維素膜(nitrocellulosee，NC)(Pall Gelman Laboratory，USA)封閉于5%脫脂牛奶中，室溫下水平搖床搖1 h。加入合適比例稀釋的IL-10抗體后封入雜交袋中，4℃水平搖床過兩夜一天。取出NC膜后，用1×TBST洗滌5 min×3次，加入與一抗對應的二抗，按1:1 000比例，封入雜交袋，擠除所有氣泡，室溫水平搖床搖1 h。用1×TBST洗二抗10 min×3次后，將化學發光液A、B等量混合，采用超高靈敏度化學發光成像系統照相并用圖像分析軟件測定灰度值。

2 結果

2.1 ICT對ERG的影響假手術組可見明顯的a波和b波；模型組在缺血時ERG波形完全消失，再灌注1 h時a波、b波稍有恢復；模型組和ICT治療組在視網膜缺血30 min時ERG的a波和b波的振幅明顯降低；再灌注后1 h，與模型組比較，ICT治療組能顯著改善ERG的a波、b波振幅降低，見圖1。提示在整體水平，ICT對視網膜缺血再灌注損傷具有保護作用。

2.2 ICT對FFA的影響與假手術組比較，模型組大鼠夾閉一側頸總動脈后視網膜血管出現痙攣、變細，視網膜后極部出現明顯的缺血變白，視乳頭周圍出現輕度水腫；缺血時及再灌注后，與模型組比較，給予ICT治療后后極部視網膜痙攣血管得到明顯恢復，見圖2。進一步提示在整體水平，ICT對視網膜I/R損傷具有保護作用。

圖1 ICT對大鼠視網膜缺血30 min及再灌注1 h后ERG的影響

圖2 ICT對大鼠視網膜缺血前、缺血30 min時及再灌注1 h后眼底照相的影響

2.3 ICT對大鼠視網膜I/R損傷時視網膜組織IL-10蛋白表達的影響圖3為Western blot的結果，結合表1所示，與假手術組比較，模型組大鼠視網膜組織IL-10蛋白表達降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；1.0 mg/kg、2.0 mg/kg及4.0 mg/kg ICT治療后，視網膜I/R損傷視網膜組織中IL-10蛋白表達水平均有升高，尤其是2.0 mg/kg ICT組，與模型組比較差異有統計學意義(q=4.592，P＜0.05)。

圖3 ICT對大鼠視網膜缺血再灌注損傷時視網膜組織IL-10蛋白表達的影響

3 討論

視網膜缺血再灌注損傷常發生在DR、ROP、視網膜血管阻塞性疾病、急性閉角性青光眼等治療過程中。缺血視網膜實現血流再通后，由于缺血導致的視網膜功能障礙并沒有得到緩解反而更加嚴重，呈現出細胞不可逆性損傷，可見，再灌注并不能使視網膜損傷得到緩解，卻使細胞死亡加劇，這就是視網膜缺血/再灌注損傷。大量研究表明，炎癥反應、細胞凋亡、興奮性氨基酸、氧自由基、NO、鈣超載等多因素、多環節參與視網膜缺血再灌注損傷[11-12]。

ERG是一種記錄視網膜的視感細胞在光刺激作用下產生的一組復合電位變化情況的方法，對掌握視網膜的狀況具有特異性。其中，a波主要由光感受器產生，b波振幅的波動對反映視網膜缺血再灌注損傷程度具有重要作用[13]。因此，檢測大鼠視網膜的ERG可以反映組織及細胞的損傷程度。本實驗結果發現，模型組眼底照相和FFA顯示夾閉大鼠一側頸總動脈后視網膜血管出現痙攣、變細，視網膜后極部出現明顯的缺血變白，視乳頭周圍出現輕度水腫，同時ERG顯示其a波和b波的振幅明顯降低；1.0 mg/kg、2.0 mg/kg及4.0 mg/kg ICT治療后，視網膜I/R損傷視網膜后極部痙攣血管得到明顯恢復，ERG的a波、b波振幅降低程度得到顯著改善。這表明本實驗制備的視網膜I/R損傷模型是成功的，且ICT對大鼠短暫性視網膜缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

有實驗發現，視網膜I/R損傷后可使內源性IL-1和IL-6表達增加，改變血流動力學，誘導白細胞向缺血組織浸潤，活化血管內皮細胞產生自由基、NO，刺激中性粒細胞釋放炎性反應蛋白和炎性介質，從而加劇炎性反應導致遲發神經元損傷[14]。IL-10作為一種炎性抑制因子，可通過抑制IL-1、IL-6等的受體的表達等來減輕炎癥反應，從而減輕組織損傷[15]。本實驗結果顯示，給予ICT治療后，視網膜IL-10蛋白表達水平升高，尤其是2.0 mg/kg ICT，與模型組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

綜上所述，ICT對視網膜I/R損傷具有一定的保護作用，且上調IL-10蛋白表達水平，抑制炎癥反應是其可能的機制之一。但ICT的化學結構與雌激素類似，是一種植物性雌激素，其對視網膜缺血/灌注損傷的保護作用機制還有待于進一步探究。

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Protective effects of icaritin on retinal ischemia/reperfusion injury in rats.

LV Hao-qin1,WU Wei-lin1,LIUYan-fang3,LIU Jin-rong1,LIU Xing-fang1,XIE Jia-li1,HUANG Zhi-hua2,WANG Hui3.1.Graduate Faculty of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,Jiangxi,CHINA;2.Department of Physiology,Gannan Medical University,Ganzhou 341000,Jiangxi,CHINA;3.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,Jiangxi,CHINA

ObjectiveTo explore the protective effects of icaritin(ICT)on retinal ischemia/reperfusion injury in rats and its potential mechanism.MethodsForty Sprague-Dawley rats were assigned into the five groups according to random number tables,with 8 cases in each group.The model of retinal ischemia/reperfusion injury was induced by the ligation of the common carotid artery unilaterally.Respectively,these rats were randomized to receive intraperitoneal injection of saline,at the dosage of 1.0 mg/kg,2.0 mg/kg,4.0 mg/kg of ICT before the induction of retinal I/R injury.The rats in the sham group were isolated without ligation of the common carotid artery,and the retinal I/R model was established in the model group and the drug group.Electroretinography(ERG)and fundus photography were used to assess functional changes in retina before and 30 minutes after ligation.One hour after reperfusion,ERG and fluorescein fundus angiography(FFA)were performed.After 6 h of reperfusion,the rats were sacrificed and the eyeballs were extracted for retina.The expression of interleukin 10(IL-10),one of anti-inflammatory mediators was quantified by Western blot analysis.ResultsCompared with the model group,the ICT groups ameliorated notably the decrease of the amplitudes of the a-and b-waves and significantly dilate retinal vessels.Besides,the level of IL-10 in the retinal tissue after retinal I/R damage increased,especially in 2.0 mg/kg ICT group(P＜0.05).ConclusionICT has a protective effect in retinal ischemia/reperfusion injury,possibly by increasing the expression of IL-10 and suppressing inflammation.

Icaritin(ICT);Retinal;Ischemia/reperfusion injury;Interleukin 10(IL-10);Electroretinography

R-332

A

1003—6350（2017）18—2932—04

2017-07-24)

10.3969/i.issn.1003-6350.2017.18.003

王輝。E-mail：gyfywanghui@163.com