結直腸癌組織中CyPJ的表達及其臨床意義

張紅波陳劍胡金晨王熙勛賈榮保姜立新

結直腸癌組織中CyPJ的表達及其臨床意義

張紅波1陳劍2胡金晨1王熙勛1賈榮保1姜立新1

目的 觀察親環素J（CyPJ）在結直腸癌組織中的分布和表達，探討其在結直腸癌發生發展中的臨床意義。方法 收集2015年5月至2016 年4月期間青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院胃腸外一科61 例結直腸癌患者的手術切除的組織標本。采用免疫組織化學染色法檢測CyPJ蛋白在61例結直腸癌組織及相應癌旁組織中的表達水平。應用SPSS 23.0統計學軟件分析結直腸癌組織中CyPJ的蛋白表達率及其與結直腸癌分各種臨床病理的關系。計數資料比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異具有統計學意義。結果 CyPJ蛋白在結直腸癌組織表現為高表達，且癌旁組織也可見陽性表達，但顏色相對較淺。CyPJ蛋白的表達主要位于細胞質，少量表達于細胞核。結直腸癌組織及癌旁組織中 CyPJ蛋白的陽性表達率分別為78.7%（48/61）、39.3%（24/61），兩者比較，差異有統計學意義（χ2=19.520，P＜0.001）。CyPJ蛋白在結直腸癌組織中的表達水平與TNM分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移比較，差異均有統計學意義（χ2=13.585，11.767，13.613，P均＜0.001）；而與其他臨床病理因素如腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤分化程度性別、年齡、及有無遠處轉移比較，差異無統計學意義（χ2=1.010，0.061，0.119，1.130，2.646，0.416，P均＞0.05）。結論 CyPJ蛋白在結直腸癌組織中強表達，提示其可能與結直腸癌的發生、發展及轉移密切相關。

結直腸腫瘤； 發展； 轉移； 親環素J

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一。在各種惡性腫瘤中，結直腸癌發病率男性位居第三位、女性位居第二位，死亡率男性和女性分別位居第四位和第三位［1］。最新研究顯示，在我國，結直腸癌是消化系統中最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率僅次于肺癌，均居惡性腫瘤的第2位，其中直腸癌約占所有結直腸癌的70%，僅2015年新發病例就達376 300例，死亡病例191 000例［2］。目前為止手術仍是治療結直腸癌最有效的方法，盡管在腫瘤的預防、治療方面取得了長足進展，但其發病率、死亡率仍居高不下，其主要原因是腫瘤的侵襲、轉移以及復發。近年來，基因和分子水平上的研究已成為結直腸癌發病機制和診療研究的熱點，親環素（cyclophilins，CyPs）與腫瘤的相關的研究已受到越來越多的關注。

CyPs也稱為親免蛋白，是一類在進化過程中結構高度保守且分布廣泛的低分子量多功能蛋白家族，具有脯氨酞順一反異構酶活性和催化脯氨酸肽鍵的順反轉換，這對蛋白質折疊和多結構域蛋白的組裝都是很重要；同時也是重要的免疫抑制劑藥物環孢菌素A（cyclospodnA，CsA）的蛋白受體［3-4］。親環素家族的成員，如CYPA［5-7］、CYPB［8-9］和CYPJ［10］等在多種消化道惡性腫瘤組織中高表達，在腫瘤的發生發展過程中起到重要作用，其致腫瘤機制尚不完全清楚。

CyclophilinJ（簡稱CyPJ，又稱PPIL3）最早于2001年從人類胎兒大腦組織CyPJ的基因序列與CyPA的相似度約為62%［11］。CyPJ主要存在于細胞質和細胞核中，具有肽脯氨酰順反異構酶活性和核酸酶活性［12-13］。已有研究表明，CyPJ在肝癌［13］、腦膠質瘤［14］等惡性腫瘤組織中高表達；CyPJ與癌細胞生長增殖、轉移、抗調亡等密切相關，可能參與惡性腫瘤發生發展。然而，CyPJ在結直腸癌發面的研究仍處于一片空白。本研究旨在采用免疫組化方法觀察CyPJ在結直腸癌及癌旁正常組織的表達情況，以明確其是否在結直腸癌組織中過表達，并分析了CyPJ臨床病理特征的關系。

資料與方法

一、標本來源

收集2015年05月至2016年04月期間“青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院胃腸外一科”收住入院的結直腸癌患者61例入組所有患者均經結直腸癌手術后石蠟切片病理確診，男性、女性患者分別是31和30例，年齡23～77歲，平均年齡（59.20±12.83）歲，采用AJCC第七版（2010）結直腸癌分期標準，Ⅰ期患者8例（13.1%），Ⅱ期23例（37.7%），Ⅲ期25例（41.0%），Ⅳ期5例（8.2%）。其中結腸癌患者有36例（59.0%），直腸癌患者25例（41.0%）。患者術前均未行新輔助治療。收集手術切除的結直腸癌組織及癌旁組織（距離陰性切緣≥5 cm）。

二、主要試劑

通用型SP免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色試劑盒及山羊抗兔IgG均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。兔抗人PPIL3多克隆抗體購自英國Abcam公司。

三、實驗方法

采用鏈酶抗生物素蛋白一過氧化物酶免疫組織化學（SP）法：將收集的標本經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片。操作步驟嚴格按照試劑說明書進行（北京中衫金橋有限公司）：將切片標本置于65 ℃烤箱烘烤2 h，依次進行二甲苯溶液脫蠟，梯度酒精水化，枸櫞酸鹽緩沖液抗原熱修復，3% H2O2消除過氧化物酶活性，一抗CYPJ抗體1：50，用隨試劑贈送的陽性片作為陽性對照，以PBS替代一抗作為陰性對照。4 ℃冰箱孵育過夜，二抗山羊抗兔抗體（北京中衫金橋有限公司）1：200，37 ℃孵育30 min，二氨基聯苯胺（DAB）染色，常規蘇木素輕度復染，脫水透明封片。

四、免疫組織化學染色結果觀察及判斷標準

由2名有經驗的病理科醫師雙盲狀態下獨立判定。CYPJ蛋白表達為細胞質內棕色或棕褐色沉著。低倍鏡（×200）下染色強度：不染色為0分；淡黃色為1分；黃色為2分；棕褐色為3分。每張切片上選取5個高倍視野（×400），計算5個視野的平均陽性細胞百分率。計數陽性細胞比例，依次為：小于10%為0分；11～25%為1分；26～50%為2分；大于50%為3分。兩者得分相乘，即為最后得分。0分為陰性；1～3分為弱陽性；4～6分為陽性；7～9分為強陽性。將陽性和強陽性定義為陽性，弱陽性、陰性定義為陰性。

五、統計學分析

應用SPSS 23.0統計軟件對數據進行分析。CyPJ蛋白表達率及其與各臨床病理因素間兩兩比較采用卡方檢驗，三組及三組以上比較時用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、免疫組織化學染色檢測CYPJ蛋白表達情況

CyPJ蛋白在CRC癌組織表現為高表達水平，且癌旁組織也可見CyPJ蛋白陽性表達，但顏色相對較淺。CyPJ蛋白的表達主要位于細胞質，少量表達于細胞核（圖1）。CRC組織中CyPJ蛋白的陽性反應呈染色均一的黃色或棕褐色色顆粒，61例CRC患者組織中 CyPJ蛋白的陽性表達率為78.7%（48/61），CRC癌旁組織CyPJ蛋白的陽性表達率為39.3%（24/61）。CRC組織中CyPJ表達陽性率明顯高于癌旁正常黏膜組織，差異有統計學意義（χ2=19.520，P＜0.001），（見表1）。

二、CRC組織中CyPJ蛋白表達水平與患者臨床病理因素的關系

通過CRC組織中CyPJ蛋白表達水平與患者臨床病理因素比較可得出以下結論：CRC組織中CyPJ蛋白的表達與不同TNM分期、有無淋巴結轉移及腫瘤浸潤深度的患者比較，差異均有統計學意義（χ2=13.585，13.613，11.767，P均＜0.05）；而與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤分化程度及有無遠處轉移的比較，差異無統計學意義（χ2=1.010，0.061，0.119，1.130，2.646，0.416，P均＞0.05），見表2。

討 論

圖1 A圖示 CRC腫瘤組織中CyPJ蛋白陽性表達于胞漿，并且可見少量在細胞核周聚集，顏色加重；B圖示癌旁組織中CyPJ蛋白陽性表達細胞漿和細胞核；C圖示 CRC腫瘤組織中CyPJ陰性表達；D圖示癌旁組織中CyPJ陰性表達（SP×400）

表1 CyPJ蛋白在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達差異（例）

近年來，由于各種生物研究技術的不斷提高，對其生物特性及與疾病相關的研究逐漸增加。在蛋白質組學及基因水平研究結果表明，CyPJ在多種惡性腫瘤中存在差異表達，可能對某些惡性腫瘤診治具有重要價值。但CyPJ在結直腸癌的研究尚處于空白，結合已有關于CyPJ研究成果，可以推斷CyPJ在結直腸癌表達情況值得深入研究。

近年來陸續發現CyPJ與多種惡性腫瘤密切相關，如腦膠質瘤、肝癌、神經母細胞瘤、宮頸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等［15-18］。Qi等［14］運用基因芯片雜交技術CyPJ基因是腦膠質瘤腦組織的差異表達基因，Northern blot檢測結果表明CYPJ在人腦膠質瘤中高表達。Chen等［13］通過Northern blot、半定量RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR和免疫組化方法分別檢測CyPJ在肝癌組織在腫瘤組織中比癌旁正常組織表達水平顯著上升，而且與肝癌病理分級有關。本實驗實時熒光定量RT-PCR檢測結直腸癌組織CyPJ mRNA在癌組織與癌旁組織相對表達量。在體外和體內實驗中分別應用RNA干擾技術或親環素抑制劑后均可導致顯著抑制癌細胞的生長和增殖，促進凋亡。這說明CyPJ是一個具有促腫瘤生長特性的蛋白。在腫瘤的發生發展過程中伴隨著細胞周期的調控過程，二者關系密切。

CyclinD1是細胞周期的啟動因子，在細胞周期G1/S期起著關鍵作用，并在G1期存在cyclinD1表達，CDK4/6與cyclinD1結合并可激活其本身，進而磷酸化下游蛋白質，如Rb，后者磷酸化后可釋放轉錄因子E2F，促進下游基因的轉錄［19-20］。最新研究表明，具有PPIase活性的 CyPJ的過表達可能促進腫瘤生長并且通過上調細胞周期蛋白D1促進細胞周期轉換從G1到S期。G1/S期在細胞周期中起著主導作用，是期限制點［13］。據研究發現CyPJ在內源性大麻素誘導的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的凋亡中下調［15］。凋亡素存在于正常細胞的細胞質，而在癌細胞中，其可遷移到細胞核引起細胞凋亡［21］。Huo等［22］研究表明PPIL3表達水平的改變可以導致Apoptin的細胞核及細胞質相互轉移，并且懷疑還有一些其他因素參與Apoptin和PPIL3之間的相互作用。有研究發現，CyPJ和CyPA均是是藥物抗性相關基因，能促進肝癌患者化療藥物的耐藥性升高；而作為CyPA和CyPJ共同抑制劑的CsA與吉非替尼的組合治療晚期NSCLC患者比單獨應用吉非替尼的更加有效［23-24］。這表明CyPJ可能成為治療癌癥的新靶點，用于開發更加有效的治療癌癥的藥物。已有研究親環素家族成員CYPA和CYPB與結直腸癌相關研究顯示，它們在結直腸癌發生發展過程中發揮重要作用。結合以上研究可以猜測CYPJ在結直腸癌中可能也發揮著重要作用，因此本實驗做了CYPJ在結直腸癌組織中表達的初步研究。

表2 61例CRC患者臨床病理因素與CYPJ蛋白陽性表達率的關系［例（%）］

本實驗首先應用免疫組化學法，檢測61例患者CRC腫瘤組織及相應的癌旁正常組織中CyPJ蛋白表達水平。本研究結果顯示，CyPJ蛋白在結直腸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，有統計學差異，然而在癌旁組織中陽性表達率也較高，考慮可能由于樣本量較少、一定讀片主觀性差別、距離腫瘤組織距離較近，有待于進一步增加樣本量，我們進一步分析結直腸癌組織中表達水平與患者各種臨床病理特征關系，結果提示癌組織中CyPJ表達上調與腫瘤分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移相關，而CyPJ表達水平與其他臨床病理因素無明顯相關，如年齡、腫瘤部位等（P＞0.05），以上結果提示我們CyPJ可能與結直腸癌發生發展及淋巴轉移密切相關。

綜上所述，CyPJ蛋白和CyPJ mRNA在結直腸癌組織中均表達上調。其中CyPJ蛋白陽性表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關。這表明CyPJ過表達與結直腸癌的發生、發展及轉移可能有密切的聯系，可能成為結直腸癌治療和診斷的新靶點。但這只是初步研究，而CyPJ在結直腸癌中發生發展過程中所起的具體作用有待進一步研究。

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Expression and clinical significance of CyPJ in colorectal carcinoma

Zhang Hongbo1, Chen Jian2,Hu Jinchen1, Wang Xixun1, Jia Rongbao1, Jiang Lixin1.
epartment of Gastrointestinal Surgery,2Central Laboratory, Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University, Yantai 264000, China

Jiang Lixin, Email: jianglixin1969@hotmail.com

Objective To investigate the expression and distribution of CyPJ in the colorectal cancer (CRC) and to explore its clinical signifcance in the development and progression of CRC. Methods The clinical data and surgical specimens of 61 patients with colorectal carcinoma who were treated from May 2015 to April 2016 that were collected from the Department of Gastrointestinal Surgery, Qingdao University Affliated Yantai Yuhuangding Hospital. Detected by immunohistochemical staining technique in 61 cases of CyPJ protein expression in colorectal carcinoma and paracarcinoma tissues levels. The relationship of the expression of CyPJ with the clinicopathological features of colorectal carcinoma was analyzed using SPSS 23. 0 statistical analysis software. The count data were evaluated using the chi-square test and Fisher exact probability. P＜0. 05 was considered as signifcant difference. Results Expression of CyPJ protein in colorectal cancer tissues is overexpressed and the positive expression of paracarcinoma tissues is visible,but the color lighter. Expression of CyPJ protein is mainly located in the cytoplasm, with little distribution in the nucleus. The positive expression rates of CyPJ protein in the CRC and paracarcinoma tissues were 78. 7% (48/61)and 39. 3% (24/61), respectively, with a signifcant difference (χ2=19. 520, P＜0. 05). The expression of CyPJ protein in patients with CRC was however associated with the TNM stage, depth of tumor invasion and lymph node metastasis (χ2=13. 585, 11. 767, 13. 613, P＜0. 05), but No signifcant correlation was found between the expression of CyPJ and age, sex, tumor size, tumor site, tumor differentiation anddistant metastasis (χ2=1. 010, 0. 061, 0. 119, 1. 130, 2. 646, 0. 416, P＞0. 05). Conclusion CyPJ protein is overexpressed in colorectal carcinoma, suggests that it may be associated with the occurrence, development and metastasis of colorectal carcinoma.

Colorectal neoplasms; Development; Metastasis; Cyclophilin J

2017-02-27）

（本文編輯：楊明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.05.007

山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金（No.2008BSA06001）

工作單位：264000 煙臺市，青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院胃腸外一科1；中心實驗室2

姜立新，Email：jianglixin1969@hotmail.com

張紅波, 陳劍, 胡金晨, 等. 結直腸癌組織中CyPJ 的表達及其臨床意義[J/CD]. 中華結直腸疾病電子雜志, 2017, 6(5):387-391.