在維吾爾族人群中探究miR-10b對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制

蘇莎莎 赫曉磊 高峰

在維吾爾族人群中探究miR-10b對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制

蘇莎莎 赫曉磊 高峰

目的 探究在多種腫瘤中均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的miR-10b 對維吾爾族結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。方法 采用miR-10b過表達(dá)或抑制的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620，在細(xì)胞水平驗(yàn)證miR-10b對細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響及對KLF4的調(diào)控作用。在臨床樣本組織中檢測miR-10b的表達(dá)以佐證miR-10b功能。結(jié)果 維吾爾族結(jié)腸癌組織按照確診時有無淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組（14例）和未轉(zhuǎn)移組（16例），結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移組miR-10b的表達(dá)較強(qiáng)（t=-5.372，P＜0.05）。在SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-10b抑制劑以敲低miR-10b，與對照細(xì)胞相比，miR-10b表達(dá)水平的降低使SW620細(xì)胞的侵襲以及遷移能力明顯降低（t=26.56，10.40，P均＜0.05）。在SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-10b抑制劑以下調(diào)其表達(dá)，通過實(shí)時定量RT-PCR及Western Blot檢測細(xì)胞中 KLF4 mRNA水平和蛋白水平的改變，結(jié)果顯示miR-10b表達(dá)水平的降低，細(xì)胞內(nèi)KLF4 mRNA水平和蛋白水平升高（t=3.78，P＜0.05），提示miR-10b對KLF4 mRNA的調(diào)節(jié)是從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平發(fā)生作用的。我們敲降miR-10b的表達(dá)或者增加KLF4的表達(dá)，通過檢測E-cadherin、cyclins D1以及p53的改變，發(fā)現(xiàn)miR-10b可能通過影響涉及EMT、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的某些獨(dú)立的信號通路，對結(jié)腸癌的細(xì)胞功能發(fā)揮重要作用。結(jié)論 在維吾爾族人群中miR-10b能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的增殖與遷移，參與結(jié)腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

結(jié)直腸腫瘤； 腫瘤轉(zhuǎn)移； 微小RNA10b； 維吾爾族

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界發(fā)病率第二的惡性腫瘤，以每年超過1 000 000 的新增病例和608 700 的死亡病例，成為威脅人類健康的主要腫瘤之一［1］。理解結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制，對我們尋找新的治療方法，提高患者 5 年生存率，降低轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率以及化療的耐藥性都有很大的幫助［2］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種廣泛存在于真核生物體內(nèi)，長度約為20～24 nt的，不編碼蛋白的核酸序列。miRNA在基因表達(dá)的過程中主要是通過促進(jìn)靶基因的降解和（或）抑制其翻譯而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)的作用，且miRNA 已被證明在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能［3］。

microRNA-10b（miR-10b）是一種在多種腫瘤中表達(dá)異常的miRNA，已有研究表明，它在不同的腫瘤中發(fā)揮了多種不同調(diào)節(jié)功能［4-5］，其機(jī)制與聯(lián)系尚不明確。新疆是一個多民族聚集地，由于其宗教文化信仰的不同，他們的生活方式、飲食習(xí)慣、膳食結(jié)構(gòu)等方面與漢族明顯不同。各民族結(jié)直腸腫瘤發(fā)病率及病死率不盡相同。本研究擬探索miR-10b在新疆維吾爾族結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和增殖中的調(diào)控機(jī)制，揭示結(jié)腸癌發(fā)病的分子機(jī)制，為新的診斷治療靶點(diǎn)提供依據(jù)和線索。

資料與方法

一、組織標(biāo)本

于2015年1月至2016年12月收集新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化科30例維吾爾族大腸癌組織按照確診時有無淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組（14例）和未轉(zhuǎn)移組（16例）。所有標(biāo)本經(jīng)內(nèi)鏡取材，所有結(jié)腸黏膜組織分別保存于液氮中。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌上皮細(xì)胞株SW620來源于一名51歲男性高加索人種大腸腺癌患者，為Duke′s D期，SW620細(xì)胞分離自該患者左鎖骨上淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移灶，具有較強(qiáng)的細(xì)胞的侵襲遷移能力，購自美國模式培養(yǎng)物集庫存（American Type Culture Collection，ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），37℃，5%的CO2條件下培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（FBS）濃度為10%，貼壁生長。

三、轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天，以3～4×105/ml的細(xì)胞密度接種6孔培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞要達(dá)到30～50%的融合。在適量不包含血清的Opti-MEM低血清培養(yǎng)基稀釋siRNA或者質(zhì)粒，輕輕混勻。使用前輕輕混合Lipofectamine 2000，然后稀釋適量的試劑到Opti-MEM低血清培養(yǎng)基，輕輕混勻后在室溫下孵育5分鐘。溶液1：240 μl無血清培養(yǎng)基＋10 μl。孵育5分鐘后，混合稀釋的寡聚物和稀釋的Lipofectamine 2000，輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘，以便允許復(fù)合物的形成。與此同時，將6孔板中的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞兩遍后，加入無血清培養(yǎng)基。將充分混合的復(fù)合物加入到每一個包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中。通過輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合。在37 ℃，5%的CO2中孵育4～6小時如果后，更換含有10%血清的培養(yǎng)基

四、免疫蛋白印跡（Western Blot）

按蛋白質(zhì)提取試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）說明書提取SW680細(xì)胞總蛋白質(zhì)，采用二喹林甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白濃度測定，常10%SDS-PAGE，利用半干電轉(zhuǎn)移儀（美國Bio-Rad公司）轉(zhuǎn)PVDF膜（美國Milipore公司）1.3 A，7 min；以10%脫脂奶粉封閉2 h，TBS洗5 min×3次；KLF4抗體（1：5 000），與PVDF膜孵育，室溫下輕柔搖動2 h。TBS-T洗滌3×5 min；TBS再洗滌5 min。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影，顯影、漂洗、定影、沖洗、晾干，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Quantity One圖像分析軟件分析條帶灰度值，用目的蛋白/GAPDH代表目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次以上。所有抗體均購自美國Abcam公司。

五、PCR檢測

結(jié)腸粘膜總RNA按Trizol說明書操作提取純化。按照Hairpin-it TM miRNAs qPCR kit（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）說明書操作，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列如下：miR-10b上游5′-GGATACCCTGTAGAACCGAA-3′，下 游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，KLF4上游5′-CGAACCCACACAGGTGAGAA-3′， 下 游5′-TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC-3′；GADPH上 游5′-GACCACAGTCCATCCCATCAC-3′， 下 游5′-CCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，均以P＜0.05表示差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。熒光定量PCR、增殖、轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞周期、凋亡實(shí)驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)（independent-samples T test）。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），先進(jìn)行方差齊性分析，如方差齊，比 較 采 用SNK法（Student- Neuman-Keuls）。方差不齊者采用基于方差不齊的多重比較方法Dunnctt′sT3法進(jìn)行。

結(jié) 果

一、維吾爾族結(jié)腸癌組織中miR-10b表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)

將30例維吾爾族結(jié)腸癌組織按照確診時有無淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組（14例）和未轉(zhuǎn)移組（16例），結(jié)果表明兩組miR-10b的表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移組miR-10b的表達(dá)較強(qiáng)（t值=-5.372，P值＜0.001）（圖1，表1）。

圖1 熒光定量PCR檢測miR-10b在大腸癌組織中的表達(dá)情況

表1 熒光定量PCR檢測miR-10b在大腸癌組織中的表達(dá)情況

二、miR-10b表達(dá)缺失可以抑制大腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移

在SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-10b抑制劑以敲低miR-10b，然后通過transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力的變化。與對照細(xì)胞相比，miR-10b表達(dá)水平的降低使SW620細(xì)胞的侵襲以及遷移能力明顯降低（圖2，表2）。

三、miR-10b調(diào)節(jié)內(nèi)源KLF4基因的表達(dá)

我們在SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor以下調(diào)其表達(dá)，24小時后收集細(xì)胞總RNA，通過實(shí)時定量qRT-PCR檢測細(xì)胞中 KLF4 mRNA水平的改變，以GAPDH的mRNA為參照。結(jié)果顯示miR-10b表達(dá)水平的降低，細(xì)胞內(nèi)KLF4 mRNA水平升高（圖3）（t=3.78，P＜0.001）。我們同時用Western Blot研究KLF4蛋白水平的改變，發(fā)現(xiàn)其變化與KLF4 mRNA水平的變化是一致的（圖3）。這提示miR-10b對KLF4 mRNA的調(diào)節(jié)是從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平發(fā)生作用的。

四、miR-10b影響大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和細(xì)胞增殖可能存在的機(jī)制

我們通過改變miR-10b和KLF4的表達(dá)，用Western Blot分析與EMT、細(xì)胞周期和凋亡關(guān)系密切的調(diào)控因子表達(dá)水平是否存在相應(yīng)的變化。（圖4A和4B），人為地敲降miR-10b的表達(dá)或者增加KLF4的表達(dá)，均能使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，而細(xì)胞周期及凋亡過程中重要的調(diào)控因子，cyclins D1和p53，表達(dá)則下降。當(dāng)在下調(diào)miR-10b的同時降低KLF4的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)上述由miR-10b下調(diào)引起的E-cadherin、cyclins D1以及p53的改變，均出現(xiàn)不同程度的減弱（圖4C）。綜上所述，miR-10b可能通過影響涉及EMT、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的某些獨(dú)立的信號通路，對大腸癌的細(xì)胞功能發(fā)揮重要作用。

討 論

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個涉及多種癌基因如原癌基因及抑癌基因多個階段的過程，是多種癌基因協(xié)同作用的結(jié)果。miRNAs作為一類對基因表達(dá)具有重要調(diào)控作用的非編碼基因，近年來受到廣泛的關(guān)注。miRNAs通過直接調(diào)控其靶基因的方式參與調(diào)節(jié)多種信號通路，從而發(fā)揮了對疾病的復(fù)雜的調(diào)控作用［6］。近年來，對于miRNA調(diào)節(jié)肝細(xì)胞肝癌、膀胱癌乳腺癌以及前列腺癌的研究多有報道［7-10］，然而miRNAs在結(jié)腸癌中的功能的研究仍然較少。本研究首次發(fā)現(xiàn)新疆維吾爾族結(jié)腸癌患者miR-10b的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討miR-10b 在結(jié)腸癌細(xì)胞中可能通過直接靶向調(diào)控KLF4進(jìn)一步影響侵襲與遷移、EMT、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的某些獨(dú)立的信號通路，對結(jié)腸癌的細(xì)胞功能發(fā)揮重要作用。

圖2 倒置顯微鏡下觀察SW620細(xì)胞在Transwell小室侵襲和遷移的情況

表2 Transwell小室侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞計數(shù)

MiR-10b定位于2號染色體短臂3區(qū)1帶1亞帶的HOXD基因簇之間，而HOX家族作為一類特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，不僅維持著正常組織的增殖分化，而且在腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移過程中也起著重要作用，因此推測miR-10b與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。研究顯示，miR-10b可以參與造血干細(xì)胞分化［11］、載脂蛋白B合成［12］等細(xì)胞生命活動。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-10在多種惡性腫瘤中過表達(dá)。miR-10b在肝臟惡性腫瘤中的表達(dá)水平明顯高于肝臟良性腫瘤及未發(fā)生瘤變的其他肝臟組織［13］；miR-10b在胰腺癌組織中表達(dá)增高，且表達(dá)水平與惡性程度相關(guān)［14］；miR-10b在人腦惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與侵襲相關(guān)因子uPAR和RHOC的mRNA和蛋白水平密切相關(guān)［15-16］；miR-10b在核仁磷酸蛋白（nueleophosmin，NPM1）突變的急性髓性白血病患者的骨髓中表達(dá)量明顯高于NPM1非突變的患者［17］。此外，包括miR-10b在內(nèi)的7個miRNA表達(dá)水平與胃癌預(yù)后明顯相關(guān)［18］。以上研究表明而miR-10b與人類惡性腫瘤密切相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)維吾爾族結(jié)腸癌患者轉(zhuǎn)移組較非轉(zhuǎn)移組miR-10b的表達(dá)增強(qiáng)，通過在SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor以敲低miR-10b，miR-10b表達(dá)水平的降低使SW620細(xì)胞的侵襲以及遷移能力明顯降低，miR-10b提示維吾爾族結(jié)腸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定作用。

圖3 A 實(shí)時定量RT-PCR檢測KLF4 mRNA水平的變化3B Western Blot檢測KLF4 蛋白水平的變化

圖4 miR-10b對大腸癌的細(xì)胞功能發(fā)揮作用可能存在的機(jī)制在SW620細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor（A），KLF4 plasmids（B）以及相應(yīng)的對照，48小時后通過Western Blot檢測KLF4，E-cadherin，cyclins D1及p53的表達(dá)。（C）在SW620細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)染KLF4 siRNA 及miR-10b inhibitor，然后用Western Blot檢測KLF4，E-cadherin，cyclins D1及p53的表達(dá)

Krüppel樣因子4（KLF4；或稱腸道富集的Krüppel樣因子）是屬于Krüppel蛋白家族的一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。KLF4具有多種生理功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中KLF4基因具有抑癌基因和癌基因的雙重功能，可以影響細(xì)胞周期的調(diào)控、凋亡以及細(xì)胞分化［19-21］。相當(dāng)一部分研究發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤，包括食管癌，胃癌，大腸癌和膀胱癌，KLF4的表達(dá)經(jīng)常發(fā)生缺失，這提示其可能具有抑癌作用。據(jù)報道，KLF4可抑制多種癌癥轉(zhuǎn)移的發(fā)生，如大腸癌、食管癌、胰腺癌細(xì)胞等［22-27］。并且在結(jié)腸癌中，KLF4可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯抑制細(xì)胞增殖；通過影響細(xì)胞增殖、凋亡和癌細(xì)胞的浸潤，從而調(diào)節(jié)食管癌的發(fā)生。KLF4在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖過程中可能起抑癌基因的作用，這恰恰與miR-10b發(fā)揮的癌基因作用相反。本研究中，我們在SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-10b抑制劑以下調(diào)其表達(dá)，結(jié)果顯示miR-10b表達(dá)水平的降低，細(xì)胞內(nèi)KLF4 mRNA水平及蛋白水平升高，這提示miR-10b對KLF4 mRNA的調(diào)節(jié)是從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平發(fā)生作用的。進(jìn)一步人為地敲降miR-10b的表達(dá)或者增加KLF4的表達(dá)，均能使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，而cyclin D1以及p53的表達(dá)則下降。當(dāng)在下調(diào)miR-10b的同時降低KLF4的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)上述由miR-10b下調(diào)引起的E-cadherin、cyclins D1以及p53的改變，均出現(xiàn)不同程度的減弱。提示，miR-10b可能通過影響涉及EMT、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的某些獨(dú)立的信號通路，對大腸癌的細(xì)胞功能發(fā)揮重要作用。

臨床樣本中miRNAs 表達(dá)水平的定量能夠真實(shí)的反映在臨床患者中特定的miRNA與腫瘤之間的關(guān)系，然而不同的病例之間個體差異較大，在樣本量不足的情況下并不能將結(jié)果一概而論。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明miR-10b能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而在臨床樣本中定量結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)移組中miR-10b的表達(dá)量高于非轉(zhuǎn)移組，初步說明miR-10b的臨床意義可能與我們的研究結(jié)果一致。

通過本課題研究發(fā)現(xiàn)，在維吾爾族人群中miR-10b能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的增殖與遷移，參與結(jié)腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

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Functions and regulation of miR-10b in Uyger colorectal cancer metastasis

Su Shasha, He Xiaolei,Gao Feng.
Department of Gastroenterology, Xinjiang Uyger Muncipal People′Hospital, Urumchi Xinjiang 830000, China

Gao Feng, Email: xjgf@sina.com

Objective To investigate the role of miR-10b in metastasis of colon cancer of Uyger patients. Methods miR-10b expression was tested on CRC samples which were divided into metastatic groups and non-metastic groups of Uyger petients.The miR-10b-overexpressed or down-regulated SW620 cells were used to test the effects of miR-10b on invasion and migration of SW620 cells and to observe how miR-10b regulating KLF4. The miR-10b/klf4-overexpressed or down-regulated SW620 cells were used to test E-cadherin, cyclins D1 and p53 expression to test the involved mechanism in the regulatory function of miR-10b on metastasis and proliferation in CRC cells. Results miR-10b was over-expressed in metastatic CRC samples, compared with non-metastic ones of Uyger patients (t=-5.372, P＜0.005). Inhibition of miR-10b in SW620 cells led to a notable reduction in invasion and migration assay compared with control cells (t=26.56,10.40, P＜0.05). We transfected miR-10b inhibitor into SW620 cells, an in crease of KLF4 mRNA level and protein level in SW620 cells was observed (t=3.78, P＜0.05). miR-10b knockdown and KLF4 overexpression upregulated E-cadherin expression. Correlated with the modulated expression of miR-10b: the inhibition of miR-10b caused downegulation of cyclins D1 and p53, which were partly abrogated after co-transfecting with miR-10b and siRNA KLF4. Conclusions Expression of miR-10b is up-regulated in the metastasis CRC tissues and cells. miR-10b controls the metastasis and proliferation of CRC cells. miR-10b may exert itseffect on metastasis and prolieration of CRC cells by regulating the expression of KLF4.miR-10b appears to modulate several independent signaling pathways that involved EMT, cell cycle and apoptosis.

Colorectal neoplasms; Neoplasm metastasis; miR-10b; Uyger

2017-04-27）

（本文編輯：王松）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.05.006

830000 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化科

高峰，Email：xjgf@sina.com

蘇莎莎, 赫曉磊, 高峰, 等. 在維吾爾族人群中探究miR-10b 對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制[J/CD]. 中華結(jié)直腸疾病電子雜志, 2017, 6(5): 381-386.