益氣活血藥物對腦梗死恢復期大鼠c-fos基因表達的影響

王嘉麟 邢 佳 賀立娟 朱曉晨 王椿野 王 蕊 鄭建穎 張 迎 李秋祥 崔洪志 秦裕駒 符海燕 高 維 郭 曉 袁清潔 高東陽 郭凱航 王建偉 王玉來 郭蓉娟

(北京中醫藥大學東方醫院，北京，100078)

益氣活血藥物對腦梗死恢復期大鼠c-fos基因表達的影響

王嘉麟 邢 佳 賀立娟 朱曉晨 王椿野 王 蕊 鄭建穎 張 迎 李秋祥 崔洪志 秦裕駒 符海燕 高 維 郭 曉 袁清潔 高東陽 郭凱航 王建偉 王玉來 郭蓉娟

(北京中醫藥大學東方醫院，北京，100078)

目的：基于c-fos mRNA觀察益氣活血藥物對腦梗死恢復期大鼠的影響。方法：以Longa的方法略作改良制作大鼠左側大腦中動脈阻塞模型，按照隨機數字表的方法隨機分為正常組、模型組、假手術組、益氣組、活血組、益氣活血組、ERK抑制劑7組，采用RT-PCR技術，在治療28 d觀察益氣活血藥物對腦梗死恢復期大鼠梗死皮層c-fos mRNA表達的影響。結果：在治療28 d后，模型組較正常組c-fos mRNA表達明顯下降(P<0.05)，益氣活血組與ERK抑制組較模型組有一定程度提高(P<0.05)，活血組與模型組比較，無明顯統計學意義(P>0.05)，益氣組的c-fos mRNA表達低于其他各組(P<0.05)。結論：在腦梗死恢復期，益氣活血藥物在一定程度上可改善腦缺血，優于單純益氣與單純活血，其療效機制可能與提高c-fos mRNA的表達有關。

腦梗死；c-fos；益氣活血

腦梗死是一種嚴重危害人類健康的常見難治性疾病，尋求有效的防治方法一直是腦梗死研究領域的熱點課題。益氣活血中藥在腦梗死恢復期的治療中起到重要價值，然而其療效的分子機制尚不清楚，為此設立本研究。通過比較單純益氣及單純活血藥物，于梗死28 d觀察益氣活血藥物對腦梗死恢復期大鼠的c-fos基因的影響，從分子生物學水平揭示益氣活血藥物治療腦梗死恢復期的療效機制，為益氣活血藥物治療腦梗死恢復期的應用提供科學依據。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SPF級Wistar大鼠42只，體重(207～238)g，平均(219.84±6.72)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2015-0001。飼養在SPF環境下，術前12 h禁食，不禁水。

1.1.2 藥物 活血藥：注射用血栓通(凍干)(三七總皂苷)(廣西梧州制藥集團股份有限公司，批準文號：國藥準字Z20025652，生產批號：14052406)。益氣藥：黃芪注射液(正大青春寶藥業有限公司，批準文號：國藥準字Z33020179，生產批號：1409051)。益氣活血藥：注射用血栓通(凍干)+黃芪注射液。ERK抑制劑：U0126(Sigma)。

1.1.3 試劑與儀器 1)試劑：TRNzol總RNA提取試劑(北京天根生化科技有限公司)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)、SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)，ROX plus(TaKaRa公司)、DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)、引物合成(Invitrogen)。2)主要儀器：渦旋振蕩儀(QL-902)(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、離心機(Centrifuge 5415D)(Eppendorf)、分光光度計(NANODROP 2000)(Therno scientific)、熒光定量PCR儀(ABI7500)(Applied Biosystems)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1)分組：按照隨機數字表法，將大鼠分為7組：正常組、假手術組、模型組、ERK抑制組、單純活血組、單純益氣組、益氣活血組，每組6只，由于本研究觀察時點較長，部分大鼠因進食困難等因素而死亡，因此，每組實際完成研究的例數為3只。2)模型制備方法：以Longa的方法略作改良，制作線栓阻塞大鼠左側大腦中動脈模型，同時按照Bederson評分觀察術后動物的神經癥狀和體征[1]。

1.2.2 給藥方法 各組均在腦梗死造模后開始給藥。中藥各組給予相應中藥注射劑腹腔注射，1次/d，連續給藥28 d，其中活血組給予血栓通注射液0.45 g/(kg·d)(配比濃度0.03 g/mL，平均給藥3.3 mL)，1次/d，益氣組給予黃芪注射液60 g/(kg·d)(配比濃度2 g/mL，平均給藥6.6 mL)，1次/d，益氣活血組給予黃芪注射液聯合血栓通注射液，1次/d，劑量同上2組。假手術組與模型組給藥時間和途徑同中藥組，以蒸餾水代替藥液。ERK抑制組：予ERK抑制劑U1026腹腔注射(0.1 mg/(kg·d)，1次/d)(配比濃度0.01 mg/mL，平均給藥2.2 mL)

1.2.3 檢測指標與方法 1)檢測指標：各組大鼠梗死皮層的c-fos mRNA的表達；2)檢測方法：RT-PCR法檢測，引物在北京Invitrogen公司合成，c-fos上游引物序列CCGAAGGGAAAGGAATAAGATG，c-Fos下游引物序列GGGCTGCCAAAATAAACTCC，PCR擴增片段長度大小173bp；內參GAPDH上游引物序列CCTTCCGTGTTCCTACCCC，GAPDH下游引物序列GCCCAGGATGCCCTTTAGTG，PCR擴增片段長度大小131 bp。采用通用方法[2]提取總RNA、反轉錄cDNA、RT-PCR擴增及檢測。按照2-△△ct相對定量計算公式:

F=2[(待測目的基因平均Ct值-待測組管家基金平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值)]

計算出相對于對照樣品，各組目的基因mRNA轉錄水平的差異。

1.3 統計學方法 將獲得的實驗數據輸入excel數據庫，以均數±標準差來表示，采用SPSS 20.0軟件作統計分析，計量資料組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義，以P<0.01為差異有顯著統計學意義。

2結果

2.1 各組一般情況觀察 造模前，各組大鼠健康狀況相同；毛色光亮、順滑；行動、飲食、飲水、排泄均正常。造模后，各組大鼠在蘇醒后即刻觀察，其中假手術組大鼠一般狀況可，毛色光亮，受傷口影響，行動緩慢，進食、飲水、排泄正常。而模型組等其他各組大鼠一般狀況較差，形體消瘦，進食量明顯減少，毛色黃暗，被毛不順滑，出現右側肢體偏癱、轉圈、不能直立，身體向右側傾倒，或者在原地向右側轉圈、追尾等，評分在1～3分，不能自主到食盒內采食，不能自主飲水，需要人為輔助喂食喂水。給藥28 d后，中藥各組、ERK抑制組大鼠偏癱癥狀均好于模型組。

2.2 各組腦梗死恢復期大鼠c-fos mRNA表達比較(RT-PCR法)以正常組的平均△CT值4.445作為對照樣本，治療28 d后，c-fos mRNA表達趨勢：正常組與假手術組>抑制組與益氣活血組>模型組與活血組>益氣組，即模型組較正常組c-fos mRNA表達明顯下降(P<0.05)，益氣活血組與ERK抑制組較模型組有一定程度提高(P<0.05)，活血組與模型組比較，無明顯統計學意義(P>0.05)，益氣組的c-fos mRNA表達低于其他各組，提示益氣活血藥物在一定程度上可提高c-fos mRNA的表達，好于單純益氣及單純活血，與ERK抑制組的療效大致相當，但仍未恢復至正常。見表1。

表1 各組對腦梗死恢復期大鼠c-fos mRNA表達的影響比較(n=3)

3討論

腦梗死是嚴重危害人類健康的重大疾病，許多患者在急性期過后，常常留有肢體癱瘓、言語障礙、吞咽困難、二便失控、生活難以自理等癥狀，這給患者帶來極大的痛苦及悲觀情緒，甚至喪失生活信心，針對腦梗死具有較高的致殘率和復發率，探討腦梗死恢復期有效的治法，促進腦梗死患者的康復，提高其生命質量，顯得非常重要。腦梗死屬于中醫“中風病”范疇，病理性質屬本虛標實，急性期多以痰、瘀實證的表現為主，而恢復期則多表現為虛(氣虛、陰虛)、瘀，益氣活血法成為重要治法，王清任創立了中風病氣虛血瘀理論，他在《醫林改錯》中說：“半身不遂，虧損元氣，是其本源”“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，提示臟腑氣血的運行均有賴于元氣的推動，氣無則血無以依附。久病或臟腑衰竭，造成元氣虛弱，氣虛鼓動無力，不能帥氣正常運行于脈中，而變成瘀血。采用益氣活血代表方劑——補陽還五湯治療中風偏癱，至今仍有很高的立論和臨床指導意義，備受后世醫家推崇。益氣活血法成為腦梗死恢復期的經典治法，大量研究證實其有效性[3-4]。

益氣活血中藥治療腦梗死有確切療效，但是其療效機制非常復雜，這與腦梗死病理機制龐雜以及中藥本身具有多水平、多通道、多靶點的效應有關。例如，益氣活血法可促進腦缺血再灌注大鼠的血管新生，改善腦循環[5]，參與調節Notch通路[6]及Wnt信號通路[7]，其中黃芪注射液[8]還可使腦缺血再灌注大鼠的神經營養因子表達。絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases，MAPKs)是細胞內的至關重要的蛋白激酶。研究證實，MAPK信號轉到通路存在于大多數細胞內，將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應(如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等)的過程中具有至關重要的作用。MAPK可分為3個主要的亞群，即細胞外信號調節激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK)，應激活化蛋白激酶(JNK)和p38MAPK。其中，ERK1/2在細胞信號轉導通路中起主要作用。ERK1/2由2種同工異構體組成，分別為ERK1和ERK2，兩者在體外有相同的作用底物，兩者在功能上的重疊。活化的ERK形成二聚體，轉入細胞核，磷酸化其他轉錄因子如癌基因c-fos、c-jun等而調控基因表達，參與細胞的增殖、存活、分化、凋亡、炎性反應和氧化應激等。c-fos是ERK下游的轉錄因子之一，正常情況下，在神經元中呈極低水平表達，但其作為細胞核的“第三信使”，通過啟動和調控某些具有特殊功能意義的靶基因的表達，對神經元的生長、分化、再生和重塑起著舉足輕重的作用。研究發現，c-fos的表達與腦缺血缺氧后神經元的信息傳遞、凋亡密切相關。腦缺血缺氧后即快速而短暫的誘導表達。c-fos的表達參與了腦缺血耐受,是腦缺血耐受的保護機制之一。c-fos蛋白的積累說明缺血后神經元蛋白質合成能力的快速恢復，并可能在學習記憶過程中起到重要作用[9-10]。也有學者認為c-fos參與腦缺血的損傷[11-15]。

本研究發現，在治療28 d時，模型組的c-fos mRNA表達量較正常組明顯下降，而經過益氣活血藥物治療后，呈現上升趨勢(見表1)，這提示在腦梗死恢復期中，c-fos本身參與腦缺血的保護作用，這與部分學者[16]的結果相一致，益氣活血藥物的療效機制之一是提高c-fos mRNA的表達。

本研究的不足之處，每組樣本量較小，需要在今后的實驗中擴大樣本量進行驗證，不妥之處望同行指正。

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(2016-09-13收稿 責任編輯：徐穎)

EffectofSupplementingQiandActivatingBloodCirculationDrugsonC-FosMrnaofRatswithCerebralInfarction

Wang Jialin，Xing Jia，He Lijuan，Zhu Xiaochen，Wang Chunye，Wang Rui，Zheng Jianying，Zhang Ying，Li Qiuxiang， Cui Hongzhi，Qin Yuju，Fu Haiyan， Gao Wei，Guo Xiao，Yuan Qingjie，Gao Dongyang，Guo Kaihang， Wang Jianwei，Wang Yulai，Guo Rongjuan

(DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China)

Objective:To observe the expression of c-fos mRNA of rats with cerebral infarction in recovery period under supplementing qi and activating blood circulation drugs.Methods:Longa method was slightly modified in making the rat model of left middle cerebral artery occlusion. According to the random number table method，the rats were randomly divided into 7 groups，including a normal group, a model group, a sham operation group, a supplementing qi group, an activating blood circulation group, a supplementing qi and activating blood circulation group, and an ERK inhibitor group. Using RT-PCR technique, we observed the effect of supplementing qi and activating blood circulation drugs on c-fos mRNA of rats with cerebral infarction after 28 days′ treatment in myocardial infarction cortex.Results:After 28 days′ treatment，compared with normal group, c-fos mRNA expression in the model group was significantly decreased (P<0.05)；c-fos mRNA expression in the supplementing qi and activating blood circulation group and ERK inhibition group increased to a certain extent than that in the model group (P<0.05)；the activating blood circulation group had no significant statistical difference with the model group(P>0.05)；c-fos mRNA expression in supplementing Qi group was lower than the other groups (P<0.05).Conclusion:In the recovery period of cerebral infarction, supplementing qi and activating blood circulation drugs can improve cerebral ischemia in a certain degree, which is better than simply supplementing qi and activating blood circulation, and its therapeutic mechanism may be related to improving the expression of c-fos mRNA.

Cerebral infarction; C-fos; Supplementing qi and activating blood circulation

R256

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.043

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2015CB554401)；高等學校博士學科點專項科研基金資助課題(20120013120014)；北京中醫藥大學東方醫院人才培養計劃項目(東方新星)(DFRC2014C01)

王嘉麟(1982.04—)，男，醫學博士，副主任醫師，碩士研究生導師，研究方向：中西醫結合防治腦病基礎與臨床研究，E-mail:WJL2008420@sina.com，Tel：(010)67689749

郭蓉娟(1964.08—)，女，醫學博士，主任醫師，博士研究生導師，北京中醫藥大學東方醫院副院長，研究方向：中西醫結合防治腦病基礎與臨床研究，Tel：(010)67689749，E-mail:dfguorongjuan@163.com