葛根配方顆粒對小鼠前列腺增生的影響

黃 霆 王安喜 朱曉雨 程義東 徐玉峰

(南京中醫藥大學第三附屬醫院泌尿外科，南京，210001)

葛根配方顆粒對小鼠前列腺增生的影響

黃 霆 王安喜 朱曉雨 程義東 徐玉峰

(南京中醫藥大學第三附屬醫院泌尿外科，南京，210001)

目的：探討葛根配方顆粒抑制小鼠前列腺增生的作用機制。方法：將60只4周齡的雄性昆明種小鼠隨機分為6組：葛根顆粒10,20,30 mg/kg組、對照組(保列治組)1 mg/kg、造模組及正常組。將除正常組外的小鼠手術去勢7 d后，給予丙酸睪酮5 mg(/kg·d)皮下注射，同時分別給予不同劑量的葛根配方顆粒、保列治灌胃3周。后摘取各組小鼠前列腺，稱重并計算前列腺指數(PI)，免疫組化檢測前列腺組織FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白的表達，免疫酶聯吸附試驗(ELISA)檢測5-還原酶活性，TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況。結果：與造模組比較，各給藥組小鼠前列腺質量、PI均顯著減小(P<0.05)，FGF2，Ki67，TGF-β1抗原表達、5-還原酶活性均顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡指數顯著增高(P<0.05)；而各項指標在葛根20，30 mg/kg組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論：葛根配方顆粒對小鼠前列腺增生有明顯抑制作用，其可能的機制是抑制FGF2，Ki67，TGF-β1抗原表達，降低5-還原酶活性，增加細胞凋亡，從而機制鼠前列腺增生。

葛根配方顆粒；前列腺增生；昆明種小鼠；保列治

良性前列腺增生癥(Benign Prostatic Hypertrophy，BPH)是常見的中老年男性進行性疾病[1]。隨著社會的老年化，BPH的患病率明顯增高[2]。但就良性前列腺增生的病因而言，國內外學者尚未明確。公認的兩大因素是年齡的增大以及雄激素失衡。目前主要的治療手段包括手術治療和藥物治療。手術主要包括傳統的開放手術和微創手術。微創手術中的經尿道前列腺電切術(TURP)、經尿道前列腺等離子雙極電切術(TUPK)已經成為國內外泌尿外科醫師治療前列腺增生術式的金標準。藥物治療則主要有-腎上腺受體阻滯劑，5-還原酶抑制劑、抑制膽固醇類藥、花粉制劑等。但這些藥物長期使用存在一定的不良反應，尋找一種有效無毒、藥食兩用的中藥防治BPH意義重大。本研究以去勢小鼠加丙酸睪酮皮下注射誘發小鼠BPH模型，觀察葛根顆粒對BPH小鼠前列腺濕重、指數、5-還原酶活性、FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白及前列腺細胞TUNEL凋亡指數的影響。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡昆明種雄性小鼠，體重(22±2)g，SPF級，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，實驗動物許可證號SCXK(滬)2014-0006。

1.1.2 藥物 葛根配方顆粒(江陰天江藥業有限公司生產，批號1602103，1512046)，每袋裝1 g相當于飲片10 g，充分溶解至20 mL沸水中，待冷卻后制成溶劑；保列治(杭州默沙東制藥有限公司生產，批號L003889)，在研缽內充分研磨后溶解至10 mL蒸餾水中制成溶劑；丙酸睪酮注射劑(上海通用藥業股份有限公司，批號131218)；科研用分析純水合氯醛(上海展云化工有限公司生產，批號20151102)，調配成10%的水合氯醛注射液。

1.1.3 試劑與儀器 Anti-TGF beta1抗體(批號601338204)、Anti-BFGF抗體(批號603933001)、Anti-Ki67抗體(批號603605803)，均購自美國ABCAM公司。二抗，兔kit(批號603447703)、NovoLinkTM polymer dilution(批號6005303)，均購自珠海泉暉公司。5α-還原酶活性ELISA試劑盒：購自Angle Gene ELISA檢測試劑盒。TUNEL染色試劑盒(50T)：In situ cell death detection kit，POD 11684817910(羅氏Roche公司生產)。

低溫高速離心機(Centrifuge 581 OR)：德國Eppendorf公司；可調式微量移液器：德國Eppendorf公司；高壓消毒鍋：上海申安醫療器械廠；超凈工作臺：上海博訊實業有限公司；酶標儀：賽默飛世爾科技(中國)有限公司;燒杯，電子天平，研缽，灌胃針，無酶EP管。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 依據參考文獻[3-5]進行動物模型制備，將小鼠隨機分為葛根10，20，30 mg/kg組、對照組(保列治組)、造模組及正常組。對照組及葛根組給藥劑量按照文獻折算成小鼠用量。除正常組外，其余各組肌內注射丙酸睪丸酮5.0 mg/(kg·d)。

1.2.2 給藥方法 葛根顆粒低、中、高劑量組分別給予10 mg/kg，20 mg/kg，30 mg/kg灌胃，保列治對照組給予1 mg/kg灌胃，連續21 d，每周復測體重調整灌胃劑量。

1.2.3 檢測指標與方法 最后1次給藥24 h后將各組動物稱重后處死，取前列腺稱濕重。

前列腺指數測定：將取材后的前列腺標本予電子天平稱重，計算前列腺濕重指數PI=前列腺濕重/小鼠體重。

根據ELISA試劑盒說明書檢測5α-還原酶活性。1)樣品制備：將組織加入適量生理鹽水進行勻漿液，1 000×g離心10 min，取上清液備用。2)標準品的稀釋：準備5只標號的小試管分別加入標準品稀釋液100 μL，然后取原濃度標準品150 μL加入一支已編好號的試管中，充分混勻；再在該試管中取200 μL加入第2支試管中，充分混勻；后依次取出100 μL加入到下一支試管中并充分混勻。在酶標包被板上設標準品孔，依次加入稀釋后的標準品50 μL。3)加樣：在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40 μL，然后再加生物素標記的抗體10 μL。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。4)溫育：用封板膜封板后置37 ℃恒溫箱中溫育30 min。5)配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。6)洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次后拍干。7)加酶：每孔加入酶標試劑50 μL。8)溫育：操作同4。9)洗滌：操作同6。10)顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。11)終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(此時藍色立轉黃色)。12)測定：用酶標儀在450 nm波長狀態下測量各孔的吸光度(A值)。

通過TUNEL染色試劑盒說明書觀察細胞凋亡情況。1)切片常規脫蠟入水。2)將一燒杯盛200 mL的0.01 mol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖液，加熱至90～95 ℃，迅速放入切片，使用680 W(80%功率)、微波照射1 min，加入雙蒸水(20～25 ℃)80 mL作迅速冷卻，將玻片移至PBS(20～25 ℃)。3)PBS洗5 min×3次。4)加20%正常牛血清室溫30 min。5)將TUNEL反應混合液加在切片上，37 ℃溫育90 min。6)PBS洗5 min×3次。7)3%H2O2甲醇液室溫阻斷10 min。8)37 ℃溫育90 min。9)加POD轉化劑，37 ℃溫育30 min。10)PBS洗5 min×3次。11)DAB/H2O2顯色。12)蘇木素淡染，常規脫水，透明，中性樹膠封固。細胞核呈棕色顆粒者為陽性細胞，結合形態特征，可確立凋亡細胞。陰性對照片無棕色顆粒。將部分前列腺標本行常規蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察小鼠前列腺腺體增生情況。每例標本均進行HE染色，光鏡下觀察細胞形態變化。HE染色步驟：10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、4 μm連續切片，HE染色，光鏡下觀察前列腺結構，照相。

按照購自ABCAM公司的抗體的說明書，并分別做出TGF，Ki67，BFGF免疫組化切片。采用免疫組化超敏二步法法。取上述標本4 μm厚連續切片，經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后行免疫組化染色。切片脫蠟至水，PBS洗3次×5 min；檸檬酸抗原修復10 min，自然冷卻；PBS浸泡5 min，3次；3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，室溫20 min；PBS浸泡5 min，3次；滴加山羊血清50 μL/片，室溫內源性生物素封閉20 min；甩除勿洗，滴加一抗(Ki-67，bFGF，TGF-β1，1∶100)50 μL/片，4 ℃過夜；PBS浸泡5 min，3次；滴加二抗50 μL/片，37 ℃ 30 min；PBS浸泡5 min，3次；滴加辣根過氧化物酶標記卵霉鏈白素50 μL/片，37 ℃30 min；PBS浸泡5 min，3次；抗原修復采用高溫高壓修復法，蒸汽冒出持續2 min后自然冷卻，其后按試劑盒說明書進行DAB顯色、蘇木精復染、中性樹脂封片、顯微鏡下觀察。TGF-β1陽性表達位于前列腺間質細胞的平滑肌細胞質、上皮細胞質內，呈淡黃色至棕褐色顆粒；FGF2陽性表達位于前列腺間質及上皮細胞質內，呈棕黃色顆粒；Ki-67陽性表達位于前列腺細胞核，呈棕色顆粒。

2結果

2.1 葛根配方顆粒對小鼠前列腺濕重、指數的影響 造模組與正常組小鼠比較，前列腺濕重及PI均顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；葛根組20，30 mg/kg及對照組與造模組比較，小鼠前列腺濕重、PI顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；葛根組10 mg/kg與造模組比較、葛根組30 mg/kg與葛根組20 mg/kg比較、對照組與葛根組20 mg/kg比較各指標間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 葛根配方顆粒對小鼠前列腺濕重、 指數的影響

注:與正常組比較，*P<0.05；與造模組比較，△P<0.05

2.2 葛根配方顆粒對小鼠前列腺組織FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白表達的影響 對各組(除正常組)小鼠前列腺組織免疫組化檢測發現，造模組FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白陽性率明顯高于其他各組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組、葛根組20，30 mg/kg的FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白陽性率顯著低于葛根組10 mg/kg，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組、葛根組30 mg/kg的FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白陽性率與葛根組20 mg/kg差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 葛根配方顆粒對小鼠前列腺組織FGF2，Ki67， TGF-β1蛋白表達的影響

注:與造模組比較，*P<0.05；與葛根組(10 mg/kg)比較，△P<0.05

2.3 葛根配方顆粒對小鼠前列腺組織5α-還原酶活性及細胞凋亡的影響 造模組小鼠前列腺組織5α-還原酶活性明顯高于正常組，而細胞凋亡指數明顯低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組、葛根組20、30 mg/K小鼠前列腺組織5α-還原酶活性明顯低于造模組，而細胞凋亡指數明顯高于造模組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組、葛根組30 mg/K與葛根組20 mg/K比較，5α-還原酶活性及細胞凋亡指數差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。6組TUNEL染色結果見圖1。

表3 葛根配方顆粒對小鼠前列腺組織5α-還原酶活性及細胞凋亡的影響

注:與正常組比較，*P<0.05；與造模組比較，△P<0.05；與對照組比較，▲P<0.05

圖1 6組小鼠前列腺TUNEL染色結果

3討論

前列腺增生在老年男性屬常見病、多發病，據報道，我國BPH發病率為7.9% ～28%[6]。本病因可導致下尿路梗阻、尿潴留、尿路感染甚至損傷腎功能[7]而越來越受到關注。到目前為止，良性前列腺增生癥的病因及發病機制尚未明確，國內外學者通過大量研究提出多種學說：上皮-間質細胞相互作用學說、細胞凋亡學說、內分泌激素作用學說、生長因子學說等[8]。葛根又名“亞洲人參”，其藥用價值極高。葛根甘、平，多食可行小便，具有活血通絡、升陽活血、活血助補的功效[9]。有研究表明，葛根異黃酮可明顯降低大鼠前列腺濕重、體積及PI，可緩解大鼠前列腺增生的癥狀，形態學上表現為上皮變薄，腺腔內分泌物減少，間質減少等[10]。大豆苷元是一種植物雌激素，其結構與雌二醇相似。曾靖[11]等研究表明：3′-大豆苷元磺酸鈉對丙酸睪丸酮所致小鼠前列腺增生具有拮抗作用；其機制可能與降低小鼠血清T，E2，T/E2及其抑制雌激素受體的表達有關。本研究通過研究葛根配方顆粒對BPH小鼠前列腺濕重、指數、5-還原酶活性，FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白及前列腺細胞凋亡指數的影響，從而初步探討葛根配方顆粒抑制小鼠前列腺增生的作用機理。

堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)在正常前列腺組織中少量表達，但在BPH中表達卻明顯升高[12]。Ki-67能客觀地反映細胞的增殖程度，因此，Ki-67高表達是細胞增殖過度的重要標志[13]。Royuela等[14]指出，在正常情況下,TGF-β1只在前列腺基底上皮細胞及結締組織基質中表達，而在BPH組織中既表達于基底上皮細胞,也表達于分泌柱狀上皮細胞。Luo[15]等研究也發現，TGF-β1在BPH組織中表達增高。醫學界大多數學者認為DHT是導致BPH的直接原因[16-17]。而5α-還原酶的作用之一是將睪酮(T)轉變為雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)，因此5α-還原酶亦可作為BPH的間接致病因素。

目前，保列治(非那雄胺)在治療BPH方面有著顯著的臨床療效[16-17]，本研究將保列治治療小鼠BPH作為對照組，觀察葛根顆粒治療小鼠BPH的療效情況。根據結果提示，保列治1 mg/kg、葛根20、30 mg/kg處理小鼠后，其前列腺濕重、指數、FGF2，Ki67，TGF-β1陽性率、5α-還原酶活性明顯下降，細胞凋亡指數明顯升高，可見葛根配方顆粒對小鼠BPH有抑制作用。而葛根20、30 mg/kg與保列治1 mg/kg在處理小鼠BPH后各參數無明顯差異，說明一定量的葛根顆?？蛇_到與保列治相近的療效。本研究不足之處是,1)小鼠模型數量較少；2)未能明確起效的具體葛根藥量。這些需要在后續的研究中進一步改進。

本研究通過檢測BPH小鼠前列腺FGF2，Ki67，TGF-β1陽性率、5α-還原酶活性，細胞凋亡指數，發現經葛根顆粒處理后，5α-還原酶活性，FGF2，Ki67，TGF-β1表達下降，細胞凋亡指數增高。有研究證明，DHT可增加FGF2生成，從而促進前列腺間質增生[18]，而DHT主要由5α-還原酶促進生成。因此我們推斷，葛根顆?？赏ㄟ^降低5α-還原酶活性，從而下調FGF2，Ki67，TGF-β1等蛋白表達，進而增加細胞凋亡。

綜上所述，葛根配方顆?？山档虰PH小鼠前列腺5-還原酶活性，抑制FGF2，Ki67，TGF-β1等蛋白表達，增加細胞凋亡，從而阻遏小鼠前列腺增生。

[1]Morán E，Budía A，Broseta E，et al.Phytotherapy in urology.Current scientific evidence of its application in benign prostatic hyperplasia and prostate adenocarcinoma[J].Actas Urol Esp，2013，37(2)：114-119.

[2]謝子平，譚艷，謝勝，等.依立雄胺治療前列腺增生臨床療效的Meta分析[J].中國性科學,2015,24(12)：35-43.

[3]徐叔云，卞濂如，陳修.藥理實驗方法學[M].2版.北京：人民衛生出版社，2005：1553.

[4]錢華，高智慧，王衍彬，等.大蕁麻根提取物對前列腺增生小鼠的治療作用[J].中國藥學雜志,2008,43(2)：108-110.

[5]苗明三，張玉林，紀曉寧,等.水蔓菁總黃酮對前列腺增生小鼠模型的影響[J].中藥藥理與臨床，2009，25(2)：63-64.

[6]張祥華，張騫，李學松，等.良性前列腺增生合并組織學前列腺炎的檢出率——兩種不同診斷標準的比較研究[J].中華臨床醫師雜志：連續型電子期刊,2007,1(7)：29-31.

[7]Lee KL，Peehl DM.Molecular and cellular pathogenesis of benign prostatic hyperplasia[J].J Urol，2004,172(5 Pt 1)：1784-1791.

[8]綦海燕.前列腺疾病基礎研究與診療新進展[M].北京：人民衛生出版社，2009.

[9]唐迎雪.論葛根活血之功用[J].中國中藥雜志,2002,27(4)：310-311.

[10]程斯倩，趙麗晶，于馨洋，等.葛根異黃酮對大鼠前列腺增生的影響[J].吉林醫藥學院學報,2014,35(1)：17-20.

[11]曾靖，胡蓉，江麗霞,等.3′-大豆苷元磺酸鈉對性激素及前列腺組織中雌激素受體的表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(10)：170-173.

[12]Ittman M，Mansukhani A.Expression of fibroblast growth factors(FGFs)and FGF receptors in human prostate[J].J Urol，1997,157(1)：351-356.

[13]林海利，鄭周達，陳森期，等.ki67、p504s、p63聯合檢測在前列腺癌中的臨床意義研究[J].醫學綜述,2008,14(11)：封2,封3.

[14]Royuela M，De Miguel MP，Bethencourt FR，et al.Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II.Comparison in human normal prostate,benign prostatic hyperplasia，and prostatic carcinoma[J].Growth Factors,1998,16(2)：101-110.

[15]Luo J，Dunn T，Ewing C，et al.Gene expression signature of benign prostatic hyperplasia revealed by cDNA microarray analysis[J].Prostate，2002,51(3)：189-200.

[16]吳曉陽，徐俊芳.保列治(非那雄胺)對良性前列腺增生(BPH)患者體內雙氫睪酮(DHT)的影響[J].世界最新醫學信息文摘：連續型電子期刊，2016,16(6)：57-58.

[17]柳建軍，曹軍，許志堅,等.非那雄胺對前列腺增生癥術中及術后出血的治療作用[J].中華泌尿外科雜志，2001，22(8)：490-492.

[18]孫自學，陳建設，王德軍,等.前列安對良性前列腺增生癥大鼠模型前列腺組織堿性成纖維生長因子的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16(15)：101-104.

(2016-10-10收稿 責任編輯：楊覺雄)

GegenpeifangGranulesinBenignProstaticHyperplasiaofMice

Huang Ting,Wang Anxi,Zhu Xiaoyu,Cheng Yidong,Xu Yufeng

(TheThirdAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210001,China)

Objective:To explore the mechanism of Gegenpeifang Granules in benign prostatic hyperplasia of mice.Methods:Sixty male mice from Kunming,all four weeks of age,were randomly divided into 6 groups,including Gegenpeifang Granules 10,20,30 mg/Kg groups,a control group (finasteride) 1 mg/Kg,a model group and a normal group.Except a normal group,mice of other groups were given testosterone propionate 5 mg / kg / d by subcutaneous injection at 7 days after surgical castration.Different dose of Gegenpeifang Granules and finasteride were given by gavage for 3 three weeks.After that,mice were broken neck to death and their prostates were weighed and prostate index (PI) was calculated,detecting the expression of FGF2,Ki67,TGF-β1by immunohisochemical method and 5a-reductase activity by ELISA,the apoptosis index by TUNEL kit.Results:Comparing with the model group,other groups had a signify-cantly reduce of prostatic volume,prostatic index,FGF2,Ki67,TGF-β1,5 a-reductase(P<0.05),while had a higher apoptosis index(P<0.05).There had no statistical difference between kudzu root20、30 mg/Kg groups and finasteride group(P>0.05).Conclusion:The Gegenpeifang Granules may shrink prostatic volume of mice by reducing the activity of 5a-reductase,inhibiting the expression of FGF2，Ki67，TGF-β1,promoting cell apoptosis,and thus straining prostatic volume of mice.

Gegenpeifang granules；Prostatic hyperplasia；Kunming mice；Finasteride

R242；R229

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.042

南京市醫學科技發展重點項目課題(ZKX14047)

黃霆(1977.01—)，男，碩士學位，副主任醫師，主要從事中西醫結合泌尿外科研究，E-mail：tingyan128@sina.com

王安喜(1965.01—)，男，博士學位，主任醫師，主要從事中西醫結合泌尿外科研究，E-mail：Szdrwang@126.com