麻子仁丸對便秘型小鼠模型通便功能、胃蛋白酶活性和對淋巴細胞增殖的實驗研究

張澤丹 譚 平

(1 中國人民解放軍福州總醫院干部保健科,福州,350025; 2 福建醫科大學福總臨床醫學院,福州，350025)

麻子仁丸對便秘型小鼠模型通便功能、胃蛋白酶活性和對淋巴細胞增殖的實驗研究

張澤丹1譚 平2

(1 中國人民解放軍福州總醫院干部保健科,福州,350025; 2 福建醫科大學福總臨床醫學院,福州，350025)

目的:觀察麻子仁丸對便秘型小鼠模型通便功能、胃蛋白酶活性和對淋巴細胞增值的實驗研究。方法:72只小鼠隨機分為空白組、模型組、觀察組,每組24只,其中模型組和觀察組建立便秘模型。空白對照組和模型組不采取任何干預,觀察組10丸/d麻子仁丸溶水灌胃。1次/d,療程7 d。通過墨汁推進法計算腸道推進率觀察小鼠通便功能;采用蘇木素-伊紅染色(HE染色)在顯微鏡下觀察腸道病理學情況;檢測胃蛋白酶活性,并通過MTT和流式細胞儀檢測淋巴細胞增殖表達情況。結果:1)觀察組和模型組的糞便粒數、糞便重量、粒糞便重量和腸道推進率均較空表組減少(P<0.05);與模型組比較,觀察組中的通便功能明顯改善(P<0.05)。2)與空白組小鼠比較,模型組小鼠結腸黏膜炎性反應細胞浸澗,肌層變薄,經過藥物治療后,炎性反應有所改善,肌層有所增厚。3)與空白組比較,模型組和觀察組2 h胃液量和胃蛋白酶活性明顯下降(P<0.05);與模型組比較,觀察組中的2 h胃液量和胃蛋白酶活性明顯提高(P<0.05)。4)與空白組比較,模型組和觀察組淋巴細胞增殖能力(P<0.05),包括T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+百分數和CD4+/CD8+比例均下降(P<0.05);與模型組比較,觀察組中淋巴細胞增殖能力(P<0.05),包括T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+百分數和CD4+/CD8+比例均身高(P<0.05)。結論:麻子仁丸能有效改善便秘型小鼠通便功能,提高小鼠胃液蛋白酶活性,其療效機制可能與提高了淋巴細胞增殖能力,尤其是T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+百分數和CD4+/CD8+比例有關。

麻子仁丸;便秘型小鼠;通便功能;胃蛋白酶活性;淋巴細胞;增殖

便秘是最常見的非器質性的慢性消化道癥狀,臨床上主要表現為糞便的性狀改變排便困難或糞便過硬以及排便節律和習慣改變出現排便次數減少等[1]。近年來便秘對機體的危害性逐漸受到人們的重視,西醫主要采用瀉藥如液體石蠟油、瓊脂、硫酸鹽等,然而這些藥物的療效多只是即時效應,但長期運用存在干擾腸道的正常的功能的危害[2]。查閱古代文獻并無便秘這一病名,古代亦和現代一樣將便秘作為一個癥狀加以描述,最早出現“后不利”“大便難”出現在《黃帝內經》,張仲景《傷寒論》約:“趺陽脈浮而澀,浮則胃氣強,澀則小便數,浮澀相搏,大便則難,其脾為約,麻子仁丸主之”。中醫學中臟腑辨證認為脾喜陽主升,胃喜陰主降,而脾胃互為表里,若脾胃或感受外邪,或內傷濕邪,則會出現脾胃陰陽失調,導致脾胃氣機升降功能失常,故本病主要病機為腸胃郁熱,脾約便秘,治療原則主要是潤腸瀉熱,行氣通便[3-5]。筆者在根據古人的經驗展開臨床運用,發現麻子仁丸臨床療效顯著,故為了進一步研究其療效機制,進行動物實驗研究,觀察麻子仁丸干預便秘小鼠對其通便功能、胃蛋白酶活性等的影響,現報道如下。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級昆明雄性小鼠72只,由本院附屬中醫藥大學實驗動物中心提供,并在該動物中心SPF級飼養。

1.1.3 試劑與儀器 4%福爾馬林溶液、蘇木素-伊紅、鹽酸溶液均購于上海西塘生物試劑有限公司,刀豆素A(ConA,Sigma,USA)、RPMI1640完全培養液(Hyclone,USA),MTT(Trevigen,USA),CD4+、CD8+抗體均購自Cell Signaling Technology,USA;酶標儀(Bioteck,USA),流式細胞儀(BD Biosciences,USA)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 72只小鼠隨機分為空白組、模型組、觀察組,每組24只,其中模型組和觀察組建立便秘模型。便秘模型制備采用饑飽失常方法,即隔天喂低纖維飼料生大米4～8 g,自由飲水1次,0.5 h/次,在此基礎上采用限制飲水和控制飲食方法造成便秘模型,造模時間共15 d。

1.2.2 干預方法 空白對照組和模型組不采取任何干預,觀察組10丸/d麻子仁丸溶水灌胃。1次/d,療程7 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 造模成功標志小鼠 大便干結、數量減少、顆粒細小。解剖見大便集中在結腸,呈球狀或串珠狀,空腸、回腸無明盈糞便殘留。

圖1 造模成本解剖標志

1.2.3.2 通便功能檢測 造模成功及觀察組停藥后,各組小鼠禁食24 h,經口0.2 mL墨汁灌胃20 min后,依次處死試驗動物,剖腹取出幽口到直腸末段的全部腸道,測量腸道全長及墨汁在腸道內推進長度,測量全程在無張力狀況下進行,并計算腸道推進率=墨染腸管長度/腸管總長度,觀察小鼠通便功能。

1.2.3.3 蘇木素-伊紅染色(HE染色) 每組8只小鼠,治療結束后,脫臼處死小鼠,10%水合氯醛注射麻醉,取距盲腸2 cm處結腸1 cm左右,用無菌外科手術剪刀從腸系膜處剪開,生理鹽水將內容物沖洗干凈,放入4%福爾馬林溶液固定48 h,常規脫水、石蠟包埋、切片,常規HE染色,在顯微鏡下觀察。

胖捕快問：“鳥窩大叔來了嗎？”這英明神武的鳥窩大師要是來的話，會帶著鳥喙尖尖的鳥面具，頭發也會亂糟糟的可以盛鳥蛋吧，袁安想。

1.2.3.4 胃蛋白酶活性檢測 每組8只小鼠,小鼠禁食不禁水16 h。采用水合氯醛麻醉大鼠并采用幽門結扎法,收集并測定單位時間內胃液量。50 mL量瓶中加入1 mL胃液,加0.065 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度,作為供試品溶液測定胃蛋白酶活力。胃蛋白酶活性單位(U/mL)=四端蛋白管透明部分長度均值平方(x2)×16。

1.2.3.5 淋巴細胞增殖檢測 每組8只小鼠,將制備好的小鼠腸細胞懸液加入96孔板培養,100 μL/孔,繼而加入經RPMI1640完全培養液配制的ConA 100 μL(終濃度5 μg/mL),每只大鼠設3復孔。置于5% CO2,37 ℃孵箱內培養44 h,加入MTT20 μL/孔(終濃度5 mg/mL),繼續培養4 h。取出培養板,3 000 r/min離心10 min,小心吸去上清液,每孔加入150 μL DMSO溶解甲瓚,輕輕震蕩,用酶標儀測定波長570 nm處OD值,檢測大鼠腸T淋巴細胞的增殖能力。另外取200 μL 1×107細胞/mL的單核細胞懸液,分別加入CD4+、CD8+抗體,常規避光孵育,流式細胞儀上樣常規制備離心后,上流式細胞儀檢測。

2結果

2.1 各組小鼠通便功能觀察比較 觀察組和模型組的糞便粒數、糞便重量、粒糞便重量和腸道推進率均較空表組減少(P<0.05);與模型組比較,觀察組中的通便功能明顯改善(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 各組小鼠糞便觀察比較

注:與模型組比較,*P<0.05;與空白組比較,△P<0.05

圖2 各組腸道推進率比較

注:與模型組比較,*P<0.05;與空白組比較,#P<0.05

2.2 各組HE染色病理性改變情況 與空白組小鼠比較,模型組小鼠結腸黏膜炎性反應細胞浸澗,肌層變薄,經過藥物治療后,炎性反應有所改善,肌層有所增厚。見圖3。

圖3 各組HE染色病理性改變情況(HE×40)

2.3 各組小鼠胃蛋白酶活性的表達情況 由表2可知,與空白組比較,模型組和觀察組2 h胃液量和胃蛋白酶活性明顯下降(P<0.05);與模型組比較,觀察組中的2 h胃液量和胃蛋白酶活性明顯提高(P<0.05)。

2.4 各組淋巴細胞增殖比較 與空白組比較,模型組和觀察組淋巴細胞增殖能力(P<0.05),包括T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+百分數和CD4+/CD8+比例均下降(P<0.05);與模型組比較,觀察組中淋巴細胞增殖能力(P<0.05),包括T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+百分數和CD4+/CD8+比例均身高(P<0.05)。見圖4和表3。

表2 各組小鼠胃蛋白酶活性的表達情況

注:與模型組比較,*P<0.05;與空白組比較,△P<0.05

圖4 MTT檢測淋巴細胞增殖能力

注：與模型組比較,*P<0.05;與空白組比較,#P<0.05

表3 流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群

注:與模型組比較,*P<0.05;與空白組比較,△P<0.05

3討論

麻子仁丸源于漢代張仲景的《傷寒論》,原方用于治療脾約便秘,方中“麻子仁二升(甘平)、芍藥半斤(酸平)、枳實半斤(炙,苦寒)、大黃一斤(去皮,苦寒)、厚樸一斤(炙,去皮,苦溫)、杏仁一斤(去皮尖,熬,別作脂,甘溫)、右六味,為末,煉蜜為丸”,組成全方,起到潤腸瀉熱,行氣通便之功。《傷寒論》之“脾約”,成無己說:“約者,約結之約,又約束也[6-7]。經曰:脾主為胃行其津液者也,今胃強脾弱,約束津液不得四布,但輸膀胱,致小便數而大便硬,故曰其脾為約”。《傷寒明理論》根據“燥者潤之”“留者攻之”“胃腸同治”的原則,故當潤腸瀉實,宜潤腸藥與瀉下藥同用,方中麻子仁性味甘平,歸屬脾、胃、大腸經,質潤多脂,功能潤腸通便,即可將脾、胃之燥熱經由大腸瀉出,是為君藥;肺與大腸相表里,杏仁向上可肅肺氣,向下可潤大腸,表里皆清;白芍養血斂陰緩燥熱之澀,同時又緩急止便秘之腹痛為臣;大黃、枳實、厚樸即小承氣湯,以輕下熱結,除胃腸燥熱為佐;蜂蜜甘緩,在幫助麻子仁潤腸通便的同時緩和小承氣湯攻下的迅猛之力,作為佐使藥;綜觀本方,在益陰增液以潤腸通便,使腑氣通津液行的基礎上,甘潤減緩小承瀉下泄熱通便的攻下之力,具有下不傷正、攻潤相合的特點,以達燥熱去,陰液復,大便自調之功[8]。我們對麻子仁丸進行為期7 d的干預,結果顯示麻子仁丸不論在改善便秘型小鼠的通便通能還是提高胃蛋白酶活性均體現了明顯的優勢,這一發現又驚人的與中醫臟腑辨證“胃腸同治”理論相呼應,再進一步機制研究中我們證實麻子仁丸的療效可能與上調淋巴細胞增殖有關。

T淋巴細胞亞群及增殖能力變化可以一定程度上體現機體的細胞免疫功能成熟T淋巴細胞在生物機體中扮演著”細胞免疫”的角色。T淋巴細胞包含CD4+和CD8+亞群,各亞群的百分數多少及CD4+/CD8+的比例是衡量機體免疫系統穩定性的關鍵因素,其中T細胞增殖是機體對抗原刺激產生免疫應答的重要反應過程,是體現機體的細胞免疫效應的重要途徑[9-12]。研究表明便秘的發生會對機體產生不良的影響,長時間持續性的便秘癥狀會降低患者免疫應答反應,導致體內淋巴細胞數目顯著減少[13]。有學者報道提出隨著便秘癥狀時間的持續性增加,小鼠重要免疫器官能力的脾臟系數及胸腺系數持續下降,進一步導致淋巴細胞發源地,骨髓的結構遭受破壞,從而直接影響了T淋巴細胞增殖、分化和成熟,而這些生理結構及過程的破壞則進一步導致了機體免疫功能的下降[14-15]。其他學者的研究也探討了便秘對腸道淋巴細胞影響的可能性,并闡述其可影響免疫功能的相關機制[16-17],在進一步的研究中發現交感神經可以釋放兒茶酚胺類物質,可以抑制淋巴細胞的免疫功能,進而影響機體的免疫功能,有潤腸作用的中藥可以增強腸道的免疫功能,這可能與中藥導致腸道交感神經興奮性降低有關[18]。我們的研究中顯示,與空白組比較,模型組和觀察組淋巴細胞增殖能力(P<0.05),包括T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+百分數和CD4+/CD8+比例均下降(P<0.05);與模型組比較,觀察組中淋巴細胞增殖能力(P<0.05),包括T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+百分數和CD4+/CD8+比例均身高(P<0.05)。即麻子仁丸的治療有助于增強T淋巴細胞的增殖活性、改善CD4+/CD8+T細胞比例。

總之,麻子仁丸可以有效改善便秘型小鼠通便功能,提高小鼠胃液蛋白酶活性,其療效機制可能與麻子仁丸可有效的調節激活免疫機制,抑制免疫細胞凋亡,增加免疫細胞的數量,增強淋巴細胞增殖活化能力有關。

[1]Zhang D,Zhu A.Pathogenesis and treatment of slow transit constipation[J].Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi,2016,19(12):1447-1450.

[2]Mínguez M,López HA,Júdez J.Use of polyethylene glycol in functional constipation and fecal impaction[J].Rev Esp Enferm Dig,2016,108(12):790-806.

[3]張騫,梁爽.麻子仁丸加減治療便秘型腸易激綜合征療效觀察[J].陜西中醫,2012,33(12):1618-1619.

[4]布明亮.中藥治療老年慢性功能性便秘36例觀察[J].實用中醫藥雜志,2010,26(9):614-615.

[5]劉暢.培本通幽湯對便秘小鼠胃腸蠕動功能影響的實驗研究[J].臨床醫藥實踐,2010,23(2):17-19.

[6]劉湘云,佃麗萍,佃澤鈿.《傷寒論》之脾約證與麻子仁丸證探析[J].中國民族民間醫藥,2016,25(3):53-53,59.

[7]劉智群,金小晶.《傷寒論》脾約證證治探析[J].河南中醫,2016,36(10):1675-1677.

[8]陳寬圣.經方治療脾胃病的理論與現代臨床應用研究[D].上海:上海中醫藥大學,2015.

[9]馮幗,何柳芳,劉素麗,等.雙歧桿菌對壞死性小腸結腸炎新生大鼠腸上皮γδT淋巴細胞的影響[J].廣東醫學,2016,37(21):3177-3180.

[10]Dieckmann NM,Frazer GL,Asano Y,et al.The cytotoxic T lymphocyte immune synapse at a glance[J].J Cell Sci,2016,129(15):2881-2886.

[11]El-Rashedi FH,El-Hawy MA,Helwa MA,et al.Study of CD4(+),CD8(+),and natural killer cells(CD16(+),CD56(+))in children with immune thrombocytopenic purpura[J].Hematol Oncol Stem Cell Ther,2017,10(1):8-14.

[12]Shao MJ,Zhu YJ,Qiu YE,et al.Changes in the Level of Immunoglobulins and CD4/CD8 Ratio in Young and Aged Mice with Estradiol Deficiency[J].Immunol Invest,2017,46(3):305-313.

[13]黃裕,陳啟儀,姜軍,等.頑固性功能性便秘患者免疫功能的變化[J].腸外與腸內營養,2015,22(6):340-342.

[14]陳東暉,陳海榮,劉志強,等.利用小鼠模型研究腸道免疫功能紊亂在腸易激綜合征致病機制中的作用[J].中華微生物學和免疫學雜志,2013,33(6):445-451.

[15]Vassallo M,Fabre R,Durant J,et al.A decreasing CD4/CD8 ratio over time and lower CSF-penetrating antiretroviral regimens are associated with a higher risk of neurocognitive deterioration,independently of viral replication[J].J Neurovirol,2017,23(2):216-225.

[16]計敏,王建蔚,藍顯明,等.不同亞型腸易激綜合征患者腸黏膜T淋巴細胞亞群的變化[J].甘肅醫藥,2016,35(3):195-197.

[17]Bruno G,Saracino A,Monno L,et al.The Revival of an “Old” Marker:CD4/CD8 Ratio[J].AIDS Rev,2017,19(2):81-88.

[18]趙海燕.麻仁軟膠囊藥理分析和合理應用[J].中國保健營養(上旬刊),2014,7(4):2268-2268.

(2017-06-05收稿 責任編輯：王明)

ExperimentalStudyonHempSeedPillonDefecationFunction,PepsinActivityandLymphocyteProliferationonRatConstipationModel

Zhang Zedan1, Tan Ping2

(1DepartmentofCadreHealthCare,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou350025,China; 2FuzhouGeneralHospitalClinicalMedicalSchool,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350025,China)

Objective: To observe the hemp seed pill on defecation function, pepsin activity and lymphocyte proliferation on rat constipation model.Methods: Seventy two rats were randomly divided into three groups: blank control group, model group and treatment group, twenty four rats in each group. The model group and the treatment group were used to establish constipation model. The blank control group and model group were not given intervention. The treatment group was given 10 hemp seed pills by gavage and in drinking water, once a day for a week. The intestine propulsion rate was calculated by ink propelling test to observe the defecation function of rats; Hematoxylin and eosin (H&E) stains were observed under the microscope to observe the conditions of intestinal tract; Pepsin activity was tested and lymphocyte proliferation was observed by using MTT and flow cytometry.Results: 1) Compared with the blank control group, fecal number, fecal weight, particle weight and the intestine propulsion rate in the model group and the treatment group decreased (P<0.05); Compared with the model group, the defecation function of the treatment group was significantly improved (P<0.05). 2) Compared with the blank control group, the inflammatory cell infiltration in colon and the thinning layer of muscle were observed in the model group. After drug treatment, the inflammation was improved and the muscle layer was thicken. 3) Compared with the blank control group, 2 h gastric juice volume and pepsin activity in the model group and the treatment group decreased significantly (P<0.05); Compared with the model group, 2 h gastric juice volume and pepsin activity in the treatment group increased significantly (P<0.05). 4) Compared with the blank control group, the lymphocyte proliferation (P<0.05), including the percentage of CD4+, CD8+T-cells and T-lymphocyte subsets (CD4+/CD8+) ratios in model group and treatment group decreased (P<0.05); Compared with the model group, the lymphocyte proliferation (P<0.05), including the percentage of CD4+, CD8+T-cells and T-lymphocyte subsets (CD4+/CD8+) ratios in the treatment group increased (P<0.05).Conclusion: Hemp seed pill can effectively improve defecation function and enhance the enzymatic activity of pepsin, which is relevant with the increasing lymphocyte proliferation, especially with the percentage of CD4+, CD8+T-cells, and T-lymphocyte subsets (CD4+/CD8+) ratios.

Hemp seed pill; Rat constipation model; Defecation function; Pepsin activity; Lymphocyte proliferation

2013年福建省衛生廳青年科研課題資助計劃(2013-1-47) 通信作者:譚平(1964.04—),女，大學本科，主任醫師，研究方向：老年醫學及保健醫學，E-mail：tanping_tp@sina.com

R285.5

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.038