基于不同精神心理應激建立IBS-D大鼠模型的比較研究

張北華 王 微 王鳳云 唐旭東

(1 中國中醫科學院西苑醫院，北京，100091； 2 北京市中西醫結合醫院，北京，100039)

實驗研究

基于不同精神心理應激建立IBS-D大鼠模型的比較研究

張北華1王 微2王鳳云1唐旭東1

(1 中國中醫科學院西苑醫院，北京，100091； 2 北京市中西醫結合醫院，北京，100039)

目的：比較基于母子分離、慢性束縛等不同精神心理應激建立IBS-D大鼠模型的特征差異，探索建立IBS-D大鼠模型的理想方法。方法：將40只新生期SD大鼠隨機分為母子分離組和非母子分離組，每組20只，母子分離組大鼠第2～14天每天與母鼠分離3 h，其余大鼠不分離。第9周，將非母子分離組隨機分為正常組(N組)、慢性束縛組(R組)，將母子分離組隨機分為單一母子分離組(S組)和聯合應激組(SR組)，每組10只。R組和SR組大鼠采用自制束縛架進行制動束縛應激，3 h/d，連續3周，其余2組不予束縛。在束縛期的最后1周，N組大鼠予生理鹽水灌胃，其余3組大鼠均予番瀉葉煎劑(0.45 g/mL)灌胃(4.5 g/kg)，連續7 d。檢測評價4組大鼠成年期束縛應激前后內臟敏感性、大便積分、曠場行為學，以及造模后血清5羥色胺水平、近端結腸常規病理、肥大細胞及嗜鉻細胞數量。結果：1)內臟敏感性：束縛應激前，經歷母子分離應激組(S組、SR組)大鼠痛覺閾值明顯低于非母子分離應激組(N組、R組)(P<0.05)；束縛應激后，S組和SR組大鼠痛覺閾值顯著低于N組(P<0.05)，R組與N組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。2)大便積分：S組、R組及SR組大便積分均明顯高于正常組(P<0.05)，SR組明顯高于R組和S組(P<0.05)。3)曠場行為學特征：束縛應激前，S和SR組大鼠曠場穿格數有低于N和R組的趨勢，但站立數均明顯低于N和R組(P<0.05)；束縛應激后，R組、S組、R組大鼠曠場穿格數及站立數均明顯低于N組(P<0.05)，SR組穿格數明顯低于S組(P<0.05)。4)血清5-HT水平：S組和SR組大鼠血清5-HT水平明顯高于N組(P<0.05)，R組與N組差異無統計學意義，SR組明顯高于S組和R組(P<0.05)。5)近端結腸病理及MC、EC數目：4組大鼠結腸病理未見異常。SR組大鼠近端結腸MC數目明顯多于N組(P<0.05)，其余各組與N組差異無統計學意義。S組、R組及SR組結腸嗜鉻細胞數目均明顯高于N組(P<0.05)，SR組與S組和R組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論：基于母子分離聯合慢性束縛應激及番瀉葉灌胃可復制IBS-D大鼠模型，該模型具有內臟敏感性增高、排便異常和抑郁樣行為特征。

腹瀉型腸易激綜合征；造模方法；精神心理應激；比較研究

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一種以反復發作的腹痛，與排便相關或伴排便習慣改變的功能性腸病[1]。根據排便習慣改變的主要表現將IBS分為IBS腹瀉型(IBS-D)、IBS便秘型(IBS-C)、IBS混合型(IBS-M)和IBS不定型(IBS-U)。我國以IBS-D最多見，一項多中心的調查研究顯示符合羅馬Ⅲ標準的IBS-D患者約占66.3%[2]。IBS-D的病因復雜，發病機制尚未完全闡明，大量的研究表明早期不良生活事件和精神疾病與IBS的發病具有密切的關系[3-4]。母子分離和束縛應激作為2種不同的精神心理因素早已被用于建立IBS動物模型研究[5-6]，這2種方法均可導致實驗大鼠內臟敏感性增高，排便異常。目前尚無公認的IBS-D動物模型，有研究采用病原體灌胃和化學物質灌腸法造模模擬IBS-D[7-8]，也有研究基于內臟高敏感動物模型疊加致瀉因素造模[9]。本研究擬采用精神心理應激疊加致瀉因素建立IBS-D大鼠模型，并比較分析不同精神心理應激造模方法的特征和差異。

1材料與方法

1.1 材料

1.1 動物 SPF級SD孕鼠8只，孕期(18±2)d，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號：SCXK(京)2012-0001，選用新生雄性大鼠造模，全部飼養于中國中醫科學院西苑醫院SPF級實驗動物中心(室溫22～25 ℃，相對濕度45% ～60%，光照周期12 h/12 h，自由進食、飲水)。

1.1.2 藥物 番瀉葉水煎劑(0.45 g生藥/mL)，由中國中醫科學院西苑醫院制劑室統一制作。

1.1.3 試劑與儀器 5-HT ELISA試劑盒，購至Abnova公司(貨號：KA1894)；肥大細胞試劑盒，購至廈門邁威生物科技有限公司(貨號：MT-022)；5-HT即用型抗體，購至北京中杉金橋生物技術有限公司(貨號：ZA-0231)；通用型二步法免疫組化檢測試劑盒，購至北京中杉金橋生物技術有限公司(貨號：PV-6000)。參照文獻[10]自制直腸測壓計，參照文獻[11]自制T型大鼠束縛架和木質曠場箱(長和寬各100 cm、高40 cm，每列每行各畫5個方格，中央9個為中央格，外周16個格稱外周格)。Multiskan MK3酶標儀由Thermo公司生產。BX51光學顯微鏡和BX41圖像采集系統均由日本Olympus公司生產。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將新生期SD大鼠隨機分為非母子分離組和母子分離組，每組20只。母子分離組大鼠從出生后第2～14天，每天與母鼠分離3 h。非母子分離組不予分離。第9周，將非母子分離組隨機分為正常組(N組)和慢性束縛組(R組)，將母子分離組隨機分為單一母子分離組(S組)和聯合應激組(SR組)，每組10只。參照文獻[11]采用自制束縛架將R組和SR組大鼠每天制動束縛3 h，連續3周，其余2組不予束縛。在束縛期第3周，正常組給予生理鹽水灌胃，其余各組給予番瀉葉水煎劑(0.45 g/mL)灌胃(1 mL/100 g)，連續1周。

1.2.2 內臟敏感性的評價 參照文獻[10]，將AWR評分=3時的壓力數作為疼痛閾值，于束縛應激前后分別采用自制直腸測壓計檢測4組大鼠的疼痛閾值，評價其內臟敏感性。

1.2.3 大便評分 參照文獻[12]制定大便評分標準：硬便1分，軟便2分，不成形便3分，觀察造模結束后4組大鼠每天6 h內的大便情況，連續觀察5 d。

1.2.4 曠場行為學評價 在束縛應激前后采用自制木質曠場箱觀察4組大鼠的行為學特征。實驗在安靜、四周無外界干擾并杜絕參照物的環境條件下進行，曠場箱上方安置攝像頭，操作者輕輕將大鼠放入曠場箱的正中格內，開始同步錄像，觀察5 min內大鼠活動情況。觀察總穿格數(三爪以上跨入同一格的次數)和站立次數(兩前肢向上抬起離開箱底面或攀伏在側壁上以后腿支撐使身體豎立的次數)。

1.2.5 檢測指標與方法 采用水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，于4 ℃ 2 500 r/min離心15 min，取上清液分裝至2 mL EP管中，-20 ℃冰箱保存備用，采用ELISA法檢測4組大鼠血清中5-HT含量。處死大鼠后，截取距盲腸3 cm處的結腸組織，放入10%的中性甲醛溶液中固定，采用石蠟包埋切片，采用蘇木精伊紅(HE)染色觀察4組結腸組織中的常規病理特征，采用甲苯胺藍改良染色法觀察肥大細胞(MC)數目，采用5-HT免疫組化法觀察嗜鉻細胞(EC)數目，每組10個樣本，每個樣本切片隨機選3個視野觀察。

2結果

2.1 內臟敏感性 在束縛應激前，與非母子分離應激組(N組、R組)比較，母子分離組(S組、SR組)痛覺閾值顯著降低(P<0.05)。在束縛應激后，與N組比較，S組、SR2組痛覺閾值均顯著降低(P<0.05)；R組痛覺閾值有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。SR組痛覺閾值均顯著低于R組、S組(P<0.05)。見表1。

2.2 大便積分 造模期間，經母子分離應激大鼠成年后大便頻次和性狀無明顯變化，短期束縛應激可使正常大鼠和母子分離大鼠的排便頻次均明顯增加，束縛一周后大便頻次逐漸減少至正常，但大便含水量明顯增加。經番瀉葉灌胃可使4組大鼠出現急性腹瀉，出現水樣便或不成形便，但隨著藥物作用的消失，大便逐漸成形，含水量仍有增加。造模結束后，與N組比較，R組、S組、SR組3組大鼠大便積分均顯著增高(P<0.05)。SR組大便積分顯著高于R組、S組(P<0.05)。見表2。

2.3 曠場行為學 在束縛應激前，母子分離應激組(S組、SR組)的穿格數較非母子分離應激組(N組、R組)有減少趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；母子分離應激組(S組、SR組)的站立數明顯低于非母子分離應激組(N、R組)(P<0.05)，SR組的站立數明顯低于R組(P<0.05)，與S組差異無統計學意義(P>0.05)。在束縛應激結束后，與N組比較，R組、S組、SR3組的站立數及穿格數均顯著降低(P<0.05)，SR組的穿格數明顯低于S組(P<0.05)，與R組差異無統計學意義(P>0.05)。SR組的站立數與R組、S組差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 血清5-HT水平 與N組比較，S組及SR組血清5-HT水平顯著升高(P<0.05)，R組與之差異無統計學意義(P>0.05)。SR組與R組、S組比較，血清5-HT水平均顯著升高(P<0.05)。見表4。

表1 4組大鼠束縛應激前后的痛覺閾值(mmHg，n=10)

注:與正常組比較，*P<0.05；與慢性束縛組比較，△P<0.05；與母子分離組比較，▲P<0.05

表2 4組大鼠造模后每天6 h內的大便積分(分，n=10)

注:與正常組比較，*P<0.05；與慢性束縛組比較，△P<0.05；與母子分離組比較，▲P<0.05

表3 4組大鼠束縛應激前后曠場行為學結果

注:與正常組比較，*P<0.05；與慢性束縛組比較，△P<0.05；與母子分離組比較，▲P<0.05

表4 4組大鼠血清5-HT水平

注:與正常組比較，*P<0.05；與慢性束縛組比較，△P<0.05；與母子分離組比較，▲P<0.05

圖1 近端結腸組織病理(HE染色，×200)

注：N為正常組；R為慢性束縛組；S為母子分離組；SR為聯合應激組

圖2 近端結腸MC細胞甲苯胺藍染色(×400)

注：N正常組；R慢性束縛組；S母子分離組；SR聯合應激組

圖3 近端結腸組織5-HT免疫組化染色(×200)

注：N為正常組；R為慢性束縛組；S為母子分離組；SR為聯合應激組

2.5 近端結腸病理及MC、EC計數 結腸常規病理顯示：N組結腸無異常，R組、S組、SR組3組結腸均有輕微充血，未見明顯中性粒細胞浸潤和間質水腫。見圖1。甲苯胺藍改良染色結果顯示：光鏡下MC胞質被染成紫紅色，胞核呈藍色，散布于黏膜固有層、黏膜下層。見圖2。與N組比較，SR組大鼠近端結腸MC數目增多(P<0.05)，與S組比較，差異無顯著性意義。免疫組化染色顯示：EC分布于腸黏膜層，主要分布于腸腺腔內，細胞呈橢圓形、星狀、楔形或不規則形，細胞質著色。見圖3。與N組比較，R組、S組、SR組3組近端結腸EC數目顯著增多(P<0.05)，SR組與R組、S組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 4組大鼠近端結腸肥大細胞、嗜鉻細胞計數

注:與正常組比較，*P<0.05

3討論

羅馬Ⅳ標準規定IBS-D除具有腹痛癥狀外，超過25%的排便為Bristol糞便性狀6型或7型，且少于25%的排便Bristol糞便性狀1型或2型。其病理生理機制主要包括內臟敏感性增高、結腸動力增強、腸上皮通透性增加、腦-腸軸功能異常等等[13-14]。所以理想的IBS-D大鼠模型應具備上述病理生理特征。

本研究結果顯示長期單一束縛應激(制動束縛，每天3 h，連續21 d)并不能提高實驗大鼠的敏感性，與文獻報道慢性不可預知應激(7種刺激因素，隨機安排不重復，連續21 d)可導致成年大鼠內臟敏感性增高結果不同[15]，可能與長期單一束縛應激導致大鼠適應有關。早在1988年Williams等[5]采用限制部分活動的急性束縛應激誘發排便異常的大鼠模型模擬IBS，該方法可促進結腸運動，增加排便粒數，這種急性束縛應激同樣可使實驗大鼠內臟敏感性增高[16]。有研究比較了急性和慢性束縛應激的差異，結果顯示連續4 d的慢性束縛應激也可提高大鼠的內臟敏感性，但低于急性束縛應激[17]。另有研究顯示急性和慢性束縛應激對大鼠內臟敏感性的影響是暫時的，急性束縛應激短暫提高大鼠血漿促腎上腺皮質激素及皮質酮水平，而慢性束縛應激可長期提高這些激素水平[18]。

本研究結果顯示母子分離應激可顯著降低實驗大鼠的痛覺閾值，說明母子分離應激可提高大鼠的內臟敏感性，與既往報道一致[6，19]。本研究發現間隔3周時間重復檢測痛覺閾值，母子分離應激所致大鼠內臟高敏感性依然存在，說明母子分離應激所致內臟高敏感性大鼠模型持久穩定，重復性好。另有研究[10]報道新生期大鼠給予結直腸擴張或芥末油灌腸，成年后內臟敏感性增高，較成年期給予相同的應激所致內臟敏感性增高更明顯。這與臨床報道早期不良事件與IBS發病密切相關結果一致[3]。

本研究結果顯示，新生期母子分離應激聯合成年期慢性束縛應激組大鼠痛覺閾值顯著降低，低于單一因素應激，說明精神心理因素聯合應激可進一步提高實驗大鼠的內臟敏感性，該方法尚無研究報道。

IBS-D腹瀉具有慢性、反復發作的特點，本研究采用番瀉葉灌胃可使大鼠出現急性腹瀉，藥效消失后則大便轉實，尚不能模擬理想的IBS-D大便特征。本研究結果顯示基于不同的精神心理應激因素，采用同樣劑量的番瀉葉灌胃也會使大鼠出現不同程度的腹瀉，聯合應激組大鼠經番瀉葉灌胃后，腹瀉時間延長、大便粒數增多，大便積分明顯高于其他各組，考慮可能與其內臟高敏感性增高和結腸轉運速度加快有關。

曠場實驗是評價嚙齒類實驗動物運動功能和狀態焦慮的經典方法，其中水平運動(穿格數)反映了動物的運動活性，垂直運動(站立數)反映了動物對新鮮環境的好奇程度[20]。本研究結果顯示：慢性束縛組、母子分離組及聯合應激組大鼠曠場穿格數和站立數均有不同程度的減少，說明精神心理應激導致實驗大鼠運動活性降低，對新鮮事物的好奇程度也降低，符合焦慮抑郁樣行為，與文獻報道基本一致[21-22]。其中以慢性束縛應激對大鼠焦慮抑郁樣行為影響最大。

從結腸病理來看，各組結腸均未出現炎性反應細胞浸潤和間質水腫，符合功能性腸病的表現，說明基于精神心理應激聯合番瀉葉灌胃所致大鼠腹瀉符合功能性腸病腹瀉特征。

臨床研究[23-26]顯示5-HT與內臟敏感性具有密切的關系，IBS-D患者的血清和腸黏膜5-HT水平升高。本研究結果顯示單一母子分離應激或母子分離聯合束縛應激均可提高大鼠血清5-HT水平，與臨床研究報道一致。5-HT作為自體活性物質，約90%合成和分布于腸嗜鉻細胞。本研究結果顯示，母子分離組及聯合應激組大鼠近端結腸組織中EC數目高于正常組，與臨床研究報道一致。

多個研究[27-30]表明IBS-D患者結腸組織中肥大細胞數目高于正常人，IBS內臟敏感性增高與肥大細胞脫顆粒具有密切的關系。本研究顯示慢性束縛應激、母子分離應激具有使大鼠結腸肥大細胞增加的趨勢，而兩者聯合可顯著增加結腸肥大細胞數目，與上述臨床報道一致。

綜上所述，新生期母子分離應激可使大鼠出現持久穩定的內臟高敏感性和抑郁樣行為；慢性束縛應激對大鼠內臟敏感性無明顯影響，但可使大鼠出現明顯的抑郁樣行為，兩者聯合具有協同效應。基于精神心理應激聯合番瀉葉灌胃可模擬IBS-D的部分病理生理特征，基于母子分離+慢性束縛聯合應激法建立IBS-D大鼠模型優于單一應激法。

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(2017-03-05收稿 責任編輯：楊覺雄)

ComparativeStudyofEstablishmentofaRatModelofIBS-DBasedonDifferentPsychologicalStress

Zhang Beihua1，Wang Wei2，Wang Fengyun1，Tang Xudong1

(1XiyuanHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100091，China; 2BeijingHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,Beijing100039，China)

Objective:To explore a reliable rat model of IBS-D by comparing the differences of different psychological stress.Methods:A total of 40 neonatal rats were randomly divided into 2 groups:normal group and maternal separation group. The pups in the maternal separation group were exposed to 3 h period daily maternal separation from postnatal day 2～14, and then they were randomly divided into single maternal separation group(S) and combined stress group (SR) in the 9th week. The pups it the other group were left untreated and then were randomly divided into normal group (N) and chronic restraint stress group(R) in the 9th week. The group R and SR underwent chronic restraint stress by specially designed restraint frame 3 h daily for 3 weeks. The group N and S were left untreated. In the 12th week, the group N was given normal saline by gavage, the group R, S and SR were given Senna decoction (0.45 g/mL) by gavage(4.5 g/kg)for 7 days. The visceral sensitivity was tested and the animal behavior was evaluated by open field test before and after the chronic restraint stress. The fecal scores were calculated. The level of serum 5-HT, the number of mast cells (MC) and enterochromaffin cell (EC) of the proximal colon colon were tested after the modeling.Results:1) Visceral sensitivity:Before the restraint stress, the pain threshold of the maternal separation group(S、SR) were lower compared to the other group(N、R) (P<0.05). After the modeling, the pain threshold of the group S and SR were lower than group N (P<0.05), and there was no significant difference between the group R and N. 2) Fecal score:The fecal scores of group S, R, SR were significantly higher than the group N (P<0.05), the fecal score of group SR was significantly higher than the group S and R (P<0.05). 3) Open field test:Before the restraint stress, the horizontal motion of the group S and SR tend to decrease compared to the group N、R, while the vertical motion of the group S and SR were significantly lower compared to the group N、R(P<0.05). After the modeling, the horizontal and vertical motion of the group S and SR significantly decreased compared to group N (P<0.05). The horizontal motion of group SR was significantly decreased compared to the group S (P<0.05). 4) Serum 5-HT:The level of serum 5-HT increased in the group S and SR compared to the group N (P<0.05).There was no significant difference between the group R and N. And the level of serum 5-HT increased in the group SR compared to the group N (P<0.05). 5) Pathological features, the number of MC and EC in the proximal colon：There were no obvious abnormality in the Pathological features.The number of the MC in group SR increased significantly compared to the group N (P<0.05)，but there was no significant difference in the other groups. The number of EC in group R,S and SR increased significantly compared to group N (P<0.05).There were no significant difference among the group R, S and SR.Conclusion:The maternal separation stress, combined with chronic restraint stress and senna decoction by gavage could duplicate the IBS-D rat model, which is characterized with visceral hypersensitivity, abnormal defecation and depression.

Diarrhea-predominant rritable bowel syndrome; Modeling methods; Psychological stress; Comparative study

R282；R-332

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.035

國家自然科學基金資助項目(81403393，81173209，81373580)

張北華(1983.09—)，男，博士，主治醫師，研究方向：中醫藥防治功能性胃腸病的基礎與臨床研究，E-mail：zhangbeihua888@163.com

唐旭東(1963.03—)，男，博士，博士研究生導師，主任醫師，研究方向：中醫藥防治消化系統疾病研究，E-mail：txdly@sina.com