正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選膽石六號(hào)湯提取工藝△

劉燕，陳積，胡姍姍，陳澤慧，田應(yīng)彪*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003)

·中藥工業(yè)·

正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選膽石六號(hào)湯提取工藝△

劉燕1，陳積1，胡姍姍2，陳澤慧2，田應(yīng)彪2*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003)

目的：優(yōu)選膽石六號(hào)湯的最佳提取工藝。方法：以總黃酮、梔子苷含量及干膏率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過L9(34)正交試驗(yàn)考察加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)膽石六號(hào)湯水提工藝的影響。結(jié)果：最佳提取工藝為加12倍量水，煎煮3次，每次1 h。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝合理可行，為膽石六號(hào)顆粒劑的制備提供參考。

膽石六號(hào)湯；總黃酮；梔子苷；干膏率；正交試驗(yàn)

膽囊炎、膽結(jié)石是常見的膽道系統(tǒng)疾病，位居腹部外科疾病中的第二位，其發(fā)病率僅次于急性闌尾炎[1]。目前，本病的治療主要采用手術(shù)治療和藥物治療，手術(shù)治療的適應(yīng)癥受到患者身體狀況、術(shù)后綜合癥的限制，而中醫(yī)中藥的治療在術(shù)前準(zhǔn)備和術(shù)后恢復(fù)都發(fā)揮了積極的療效，越來越受到廣大患者的青睞[2]。膽石六號(hào)湯是遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院研制的一種中藥口服制劑，由金錢草、木香、梔子等八味中藥組成，具有消炎、利膽、解熱之功能，主要用于治療膽囊炎、膽囊結(jié)石、重癥膽囊炎等癥，療效確切[3-4]。課題組在前期實(shí)驗(yàn)中證明，膽石六號(hào)湯具解熱、鎮(zhèn)痛、利膽、抗炎的功能[5]，對(duì)大鼠肝臟有一定的保護(hù)作用[6]，初步探討了該制劑防治膽囊炎、抗膽囊結(jié)石作用的機(jī)制[7-9]，并未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[10]。然而，該制劑一直以湯劑形式應(yīng)用于臨床，湯劑有久置易發(fā)霉、攜帶不方便、服用量大、不易貯存等不足。故本實(shí)驗(yàn)擬將其改制成顆粒劑，以期克服湯劑的缺點(diǎn)[11]。

目前，尚沒有關(guān)于膽石六號(hào)湯提取工藝的研究報(bào)道，為了建立更加全面的膽石六號(hào)湯的提取工藝，提高其臨床療效，以總黃酮、梔子苷含量和干膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)提取工藝中加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察。黃酮類成分為該復(fù)方中多種藥材的有效成分，藥理研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛等活性，還具有抗菌、抑菌等作用，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌等有抑制作用[12-13]。梔子中的有效成分梔子苷具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、利膽等作用[14-15]。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)膽石六號(hào)顆粒的水提工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用UV法測(cè)定總黃酮含量，HPLC法測(cè)定梔子苷含量，為該顆粒劑的后期研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器

Agilent1260高效液相色譜儀；T9CS雙光束紫外-可見光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-ⅢG循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；DL-820D智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；HH-S6二列六孔水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工有限公司)；98-Ⅱ-B磁力攪拌電熱套(天津泰斯特儀器有限公司)；101-4電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；ME204E電子天平(梅勒特-托利多儀器上海有限公司)。

1.2試藥

梔子苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用，成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：151204)；蘆丁對(duì)照品(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，批號(hào)：160602)；膽石六號(hào)處方藥材：金錢草(批號(hào)：150701)、木香(批號(hào)：150801)、虎杖(批號(hào)：150701)、枳殼(批號(hào)：151001)、梔子(批號(hào)：150701)、延胡索(批號(hào)：150901)、大黃(批號(hào)：140901)、芒硝(批號(hào)：150901)均購(gòu)于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1膽石六號(hào)顆粒的水提工藝

按處方比例稱取金錢草、木香、梔子等藥材，依一定的料液比加水煎煮一定的次數(shù)，濾過，合并濾液，將濾液濃縮定容至25mL，得水提液樣品，備用。

2.2梔子苷含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱：GeminiC18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.3%磷酸溶液(12∶88)；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。供試品色譜中梔子苷與最近組分的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4500，見圖1。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.梔子苷。圖1 膽石六號(hào)湯提取液HPLC圖

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含23.1μg的梔子苷對(duì)照品溶液，置涼暗處保藏，備用。

2.2.3供試品溶液的制備 精密量取提取液2mL，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理40min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.2.4陰性供試品溶液的制備 按處方稱取不含梔子的其余處方量藥材，按2.2.3項(xiàng)下方法制成陰性供試品溶液，即得。

2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取梔子苷對(duì)照品儲(chǔ)備液2、4、6、8、10、12、16μL，注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得梔子苷回歸方程Y=331.14X-19.236，(r=0.9999，n=7)，表明梔子苷在0.046～0.368μg線性關(guān)系良好。

2.2.6精密度試驗(yàn) 精密吸取梔子苷對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測(cè)定峰面積。測(cè)得梔子苷對(duì)應(yīng)峰峰面積的RSD為0.40%，表明儀器精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，測(cè)定梔子苷的峰面積，計(jì)算RSD分別為0.58%，表明樣品在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品6份，按2.2.3項(xiàng)下方法處理，每份精密吸取10μL，按2.2.1色譜項(xiàng)下測(cè)定，測(cè)得梔子苷的平均含量為0.253mg·mL-1(n=6)，RSD為2.04%。表明該方法重復(fù)性好。

2.2.9加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品溶液6份，精密加入梔子苷對(duì)照品溶液1mL，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1色譜項(xiàng)下測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率分別為99.85%，RSD值分別為1.26%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3總黃酮含量測(cè)定

2.3.1對(duì)照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對(duì)照品20mg，加70%乙醇適量，使其溶解，用70%乙醇定容至50mL即可。

2.3.2供試品溶液的配制 精密量取提取液1mL，置25mL量瓶中，加70%乙醇20mL，超聲處理15min，放冷，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取蘆丁對(duì)照品0.5、1、2、3、4、5、6mL，分別置于25mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液1mL，搖勻，放置6min，再加入10%的硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，最后加入4%的NaOH溶液10mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15min。以相應(yīng)顯色劑為空白對(duì)照，在510nm處測(cè)定吸光度，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=12.539X-0.03183，(r=0.9998)，表明蘆丁在0.008～0.096mg·mL-1與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液，在波長(zhǎng)510nm處按照2.3.3項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定吸光度6次，其蘆丁吸光度RSD值為0.42%。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液1mL，按2.3.3項(xiàng)下操作，分別于顯色后0、5、10、15、20、25、30min測(cè)定吸光度，其RSD為0.58%，表明制備的供試品溶液在顯色之后30min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品6份各1mL，于2.3.3項(xiàng)下操作，測(cè)得吸光度平均值為0.408(n=6)，RSD為0.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7加樣回收率試驗(yàn) 量取已知含量的樣品6份，依2.3.2中供試品的制備方法制備溶液，取1mL供試品溶液，采用加樣回收試驗(yàn)，分別加入2mL的蘆丁對(duì)照品溶液(0.4mg·mL-1)，置于25mL容量瓶中，按2.3.3項(xiàng)下步驟進(jìn)行操作測(cè)定其吸光度，平行操作6份，計(jì)算其平均加樣回收率為98.2%，RSD為0.87%，表明此方法的回收率良好。

2.4干膏率的測(cè)定

分別精密量取各實(shí)驗(yàn)濃縮液5mL，分別置已干燥至恒重的潔凈蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105 ℃烘箱下干燥3h后取出，放入干燥器中冷卻，稱重，計(jì)算干膏得率[16]。

2.5水提工藝單因素試驗(yàn)

設(shè)定其他條件不變的情況下，分別考察提取時(shí)間、加水量、提取次數(shù)對(duì)總黃酮、梔子苷含量綜合評(píng)分的影響，見表1。

表1 水提工藝單因素變化條件

2.5.1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮、梔子苷含量綜合評(píng)分的影響 根據(jù)圖2(A)可知，當(dāng)煎煮時(shí)間為0～1.5 h時(shí)，其總黃酮、梔子苷含量綜合評(píng)分結(jié)果不斷升高，當(dāng)達(dá)到1.5 h時(shí)最高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，綜合評(píng)分結(jié)果逐漸下降，所以選擇1.5 h為中心點(diǎn)。

2.5.2 加水量對(duì)總黃酮、梔子苷含量綜合評(píng)分的影響 根據(jù)圖2(B)可知，隨著加水量的增加，綜合評(píng)分結(jié)果不斷升高，其當(dāng)加水量為12倍時(shí)，綜合評(píng)分結(jié)果最高，所以選擇12倍時(shí)為最佳。

2.5.3 提取次數(shù)對(duì)總黃酮、梔子苷含量綜合評(píng)分的影響 根據(jù)圖2(C)可知，3～4次的綜合評(píng)分為最佳，應(yīng)考慮節(jié)約時(shí)間和溶劑用量，正交試驗(yàn)時(shí)，最終選擇1、2、3次進(jìn)行考察。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果圖

2.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇加水量(A)、煎煮時(shí)間(B)、煎煮次數(shù)(C)為考察因素，選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表2，提取液濃縮定容至25mL，以總黃酮、梔子苷含量及干膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)膽石六號(hào)顆粒的提取工藝條件進(jìn)行分析，試驗(yàn)安排與結(jié)果見表3。

表2 膽石六號(hào)湯水提工藝正交試驗(yàn)因素水平

表3 膽石六號(hào)湯水提工藝正交試驗(yàn)安排及直觀分析

注：綜合評(píng)分=(Xi/Xmax×0.35×100+Yi/Ymax×0.45×100+Zi/Zmax×0.2×100)×100%。

表4 綜合評(píng)分方差分析

注：F0.05(2，2)=19.0。

由直觀分析可知，各因素影響膽石六號(hào)湯提取工藝順序?yàn)镃>A>B，方差分析結(jié)果表明，因素C對(duì)提取工藝有顯著性影響，因素A、B則無顯著性影響，確定最佳水提取工藝為A2B1C3，即加12倍量水，煎煮3次，每次1 h。

2.7驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步確定最佳提取工藝，對(duì)正交試驗(yàn)優(yōu)選出來的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，稱取與正交試驗(yàn)等量的藥材，按優(yōu)選的最佳水提取工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，并測(cè)定提取液中總黃酮、梔子苷的含量和出膏率，結(jié)果見表5。該結(jié)果表明，優(yōu)選出的工藝條件穩(wěn)定、合理、可行。

表5 提取工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

本方是由多味中藥組成的一個(gè)復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，長(zhǎng)期以來臨床以湯劑給藥，為遵循中醫(yī)傳統(tǒng)用藥的習(xí)慣和有效降低生產(chǎn)成本，實(shí)驗(yàn)采用水為溶媒進(jìn)行提取，并采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其提取工藝。膽石六號(hào)湯由8味藥材組成，黃酮類成分為該處方多味藥材的有效成分，具有抗菌、消炎等活性；梔子為其處方藥材中主要成分之一，具有抗炎、利膽、解熱等作用。出膏率是水提工藝提取效率的傳統(tǒng)指標(biāo)，雖然不能反應(yīng)有效成分的含量，但是可為后期制作顆粒劑提供參考依據(jù)，故選擇總黃酮類、梔子苷含量及出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將總黃酮的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.45，梔子苷設(shè)為0.35，出膏率設(shè)為0.2，以加權(quán)綜合評(píng)分作為篩選最佳工藝的依據(jù)，使結(jié)果更科學(xué)、合理。

本實(shí)驗(yàn)所選擇的3個(gè)因素對(duì)提取工藝有不同的影響，其中提取次數(shù)影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。直觀分析和方差分析結(jié)果表明，加水量為12倍，提取3次，每次1 h是制備膽石六號(hào)湯的最佳提取工藝。按最佳提取工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，有效成分指標(biāo)測(cè)定值較高，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，可為膽石六號(hào)湯提取生產(chǎn)工藝的制定提供參考依據(jù)。

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OptimizationofExtractionProcessforGallstoneVIDecoctionbyOrthogonalTest

LIU Yan1，CHEN Ji1，HU Shanshan2，CHEN Zehui2，TIAN Yingbiao2*

(1.ZunyiMedicalCollege，GuizhouZunyi563003，China；2.AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，GuizhouZunyi563003，China)

Objective：To optimize the extraction process of gallstone VI decoction.Methods：The comprehensive scores of total flavonoids，geniposide content and dry extract rate were used as indicators，the effect of amount of water，extraction time and frequency on gallstone VI of water extraction process were observed on the basis of single factor tests through L9 (34) orthogonal design.Results：The optimum process was determined as follows：adding 12 times of water and extracting 1h for 3 times.Conclusion：This optimized process is reasonable and feasible，which could guide industrial production.

Gallstone VI decoction；total flavonoids；geniposide；dry extract rate；orthogonal experiment

貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目[黔教合K字(2012)054號(hào)]；貴州省科技計(jì)劃課題[黔科合SY字(2015)3028號(hào)]；貴州省藥劑學(xué)研究生卓越人才培養(yǎng)計(jì)劃[黔教研合ZYRC字(2014)019]

] 田應(yīng)彪，主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)與新藥研發(fā);Tel：(0851)28608517，E-mail：tybczh@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.024

2016-08-13)

*[