人參致病菌拮抗菌株的篩選及鑒定△

邵天蔚，丁萬隆，李勇

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

·中藥農業·

人參致病菌拮抗菌株的篩選及鑒定△

邵天蔚，丁萬隆，李勇*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京100193)

目的：篩選對人參黑斑菌、人參銹腐菌等人參致病菌有較好抑菌活性的微生物菌株，為人參病害生防防治提供參考依據。方法：采用平板稀釋法從人參栽培土壤和菌劑產品中分離菌株；以人參致病菌為靶標，采用對峙培養法篩選拮抗菌；分別采用16S rDNA和28S rDNA序列分析方法鑒定細菌和真菌菌株的分類學地位。結果：共計從人參栽培土壤中分離到66株菌，其中菌株X對人參致病菌表現較好抑菌活性；從商品化菌劑中分離出17株菌，其中菌株QM、BM2、HZ3、GG、HC和DD對人參致病菌表現較好抑菌活性。經鑒定，菌株X為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，QM、BM2和HZ3為甲基營養型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)，GG為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，HC為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，DD為平展木霉(T.effusum)。結論：篩選出的7株拮抗菌對多種人參致病菌有較好抑菌活性，菌株X可用于生防菌劑開發，與菌株QM、BM2、HZ3、GG、HC和DD對應的商品化菌劑可用于人參病害防治。

人參；病害；拮抗菌；篩選；鑒定

人參PanaxginsengC.A.Mey.是五加科多年生宿根植物，我國傳統名貴中藥材。我國人參栽培面積居世界首位，吉林省長白山區作為我國人參主產區，年人參產量超過全國80%[1]，出口量占世界總量60%，在世界人參產業中具有舉足輕重的地位[2]。人參根部發病率平均約20%左右，重者高達70%以上，嚴重影響人參的產量和品質[3]。土傳根病防治一直是人參生產中的難點問題。目前，人參病害防治仍主要依賴化學殺菌劑，長期使用不僅嚴重破壞自然生態環境，導致人參農藥殘留超標，也給人參用藥安全帶來重大安全隱患。

隨著人們對中藥材農藥殘留問題的認識日益深刻以及環保理念的逐漸深化，中藥材病害生物防治逐漸被愈來愈多的人所認可[4-5]。針對中藥材病害，篩選高效、穩定的生防菌株對中藥材病害防治具有重要意義。本研究以人參常見病害為靶標，從人參根圍土和市售菌劑中篩選對人參致病菌具有較好抑菌活性的菌株，借助16S rDNA或28S rDNA序列分析對菌株進行分類學鑒定，本研究結果對開展菌株抑菌機理研究以及菌劑產品合理應用等均具有很好的指導作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株和土壤 人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans、人參黑斑菌Alternariapanax、人參根腐菌Fusariumsolani、人參灰霉菌Botrytiscinerea由本課題組保存。土壤樣品于2015年7月采自吉林省靖宇縣水庫屯試驗地、板石參場、鎮郊參場和藥用植物研究所內試驗田的人參栽培土壤。商品化菌劑及其生產廠家如表1所示。

表1 微生物菌劑來源

1.1.2 培養基 PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1000 mL，pH 7.0；NA培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、水1000 mL、pH 7.4～7.6；LB培養基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，瓊脂10～15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1菌株分離、純化與保存 采用梯度稀釋法分離土壤樣品中的微生物菌株。采回土樣編號分組，風干后過20目篩，分別稱取10g置于三角瓶中，加入90mL無菌水及玻璃珠振蕩10～30min得到土壤樣品懸液。1mL懸濁液，加入9mL無菌水后40℃熱浴20min，得菌懸液。取1mL菌懸液體，梯度稀釋10-3、10-4、10-5，分別取100μL，均勻涂布在NA培養基表面，3次重復。28℃恒溫培養2～3d，挑取性狀差異明顯的單菌落進行編號，劃線法純化培養，4℃保藏，備用。拮抗細菌分離采用LB培養基，35℃暗培養3～5d，拮抗木霉菌分離采用PDA培養基，25℃暗培養5～7d，分離得到的拮抗菌株純化后，4℃保存。

1.2.2抑菌活性篩選 以四種人參致病菌為靶標，采用對峙培養法篩選拮抗菌株。將預先培養好的人參致病菌菌餅置于PDA培養基中心，四周距平板邊緣1cm處對稱接種拮抗菌株，每種處理3～5次重復。28℃暗培養5～7d，觀察，記錄對照及處理組人參致病菌菌落直徑。

1.2.3抗菌株的鑒定 采用16SrDNA序列分析方法鑒定所得細菌菌株。取適量細菌至無菌水中，充分震蕩成細菌懸濁液，用引物fD1(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和rP1(5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細菌16SrDNA。擴增體系25μL，包括：10×PCRBuffer(100mmol·L-1Tris，500mmol·L-1KCl，20mmol·L-1Mg2+，pH8.3)2.5μL，dNTP(2.5mmol·L-1)1μL，引物各1μL，TaqDNA聚合酶(2.5U·μL-1)1μL，模板DNA(菌懸液)1μL，重蒸水補足25μL。擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30次循環，72℃延伸10min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。FungalDNAKit(OMEGA)用于真菌基因組提取，通用引物NL-1(5’-GCATATCAATAAGCGGAG-3’)和NL-4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)用于真菌菌株28SrDNA序列擴增。擴增體系25μL，包括：2×PCRPremixTaqTM(Verdion2.0TakaRa)12.5μL，ddH2O5.5μL，DNA模板5μL，NL-1和NL-4各1μL。PCR程序：95℃預變性5min，94℃變性1min，52℃退火30s，72延伸1min，32次循環，72℃延伸10min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產物送三博遠志公司測序，測得序列與GenBank數據庫進行BLAST分析，MEGA6.0軟件分析序列同源性，以Neighbor-joining方法構建系統發育樹，Bootstrap(1000次重復)進行檢驗。

1.3數據分析

用Excel2010對統計數據進行計算和制作圖表。

2 結果與分析

2.1拮抗菌株分離、純化

共計從人參栽培土和菌劑產品中分離到83株菌。由人參栽培土壤分離到66株，從商品化菌劑中分離到17株(表2)。

2.2拮抗菌株篩選

研究發現，對人參致病菌有抑菌活性的菌株共計13株。其中，對人參黑斑菌有抑菌作用的菌株13株，占拮抗菌總株數的100%；對人參銹腐菌有抑菌作用的菌株9株，占拮抗菌總株數的69.23%；對人參根腐菌有抑菌作用的菌株8株，占拮抗菌總株數的61.54%；對人參灰霉菌有抑菌作用的菌株7株，占拮抗菌總株數的53.85%(表3)。

表2 分離所得菌株編號與數目

在上述13株具有抑菌效果的微生物菌株中，QM、BM2、HZ3、GG、X、HC和DD對4種供試人參致病菌均有較好的抑菌活性(表4)。

2.3拮抗菌株鑒定

5株拮抗細菌同源性分析結果表明，菌株QM、BM2、HZ3與甲基營養型芽孢桿菌B.methylotrophicus(KC790324，JF460743)的序列同源性最高(99%)，它們位于系統發育樹同一分支上(圖1)，綜合同源性比對結果，QM、BM2、HZ3屬于甲基營養型芽孢桿菌B.methylotrophicus。菌株GG與枯草芽孢桿菌B.subtilis(AB924083)的序列同源性達99%，二者位于系統發育樹同一分支上(圖1)。綜合同源性比對結果，GG屬于枯草芽孢桿菌B.subtilis。菌株X與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens(HQ003407)的同源性達99%，二者位于系統發育樹同一分支上(圖1)。綜合同源性比對結果，X應屬于解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens。

表3 分離菌株的抑菌活性

注：+.菌株對病原菌具有抑菌效果；-.菌株對病原菌無抑菌作用。

表4 7株分離菌對人參致病菌生長的抑制情況

2株拮抗真菌同源性分析結果表明，菌株HC與棘孢木霉T.asperellum(KF723005)的序列同源性達99%，它們位于系統發育樹同一分支上(圖2)。綜合同源性比對結果和HC與棘孢木霉在發育系統中的位置，該菌應屬于棘孢木霉T.asperellum。菌株DD與平展木霉T.effusum(KC171306)序列同源性達99%，二者位于系統發育樹同一分支上(圖2)。綜合同源性比對結果和DD與平展木霉在發育系統中的位置，該菌應屬于平展木霉T.effusum。

圖1 細菌菌株QM、GG、BM2、HZ3和X系統發育樹

圖2 真菌菌株的系統發育樹

3 討論

芽孢桿菌屬是普遍用于防治植物病害的菌屬，具有抗逆性強、耐高溫、易貯存、對人畜無毒害、環境友好等優點，是較為理想的生防微生物資源[6]。研究表明，芽孢桿菌對人參銹腐菌和人參黑斑菌抑菌效果明顯且防治效果穩定[7-8]。甲基營養型芽孢桿菌是2011年才被鑒定的新種[9]，劉利強等[10]利用該菌種防治黃瓜灰霉病。枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的重要成員，在防治傳統農業產品病害的同時，也逐漸用于人參病害生物防治。胡陳云等[11]分離出的枯草芽孢桿菌分泌的抑菌脂肽能夠導致人參黑斑菌和人參銹腐菌菌絲體的形態異常和發育畸形；賈斌等[12]利用解淀粉芽孢桿菌拮抗人參黑斑病菌，抑菌率達到80%。本實驗篩選出的5株拮抗細菌均為芽孢桿菌。實驗結果表明，人參病原菌與拮抗細菌對峙培養時抑菌帶明顯，推測可能是拮抗細菌生成的次生代謝產物及幾丁質酶、纖維素酶、葡聚糖酶等降解酶類對病原菌生長產生的抑制作用。

應用于植物病害防治的生防真菌主要有木霉(Trichodermaspp.)、小盾殼霉(Conithyriumminitans)和鏈霉菌(Streptomycetaceae)等。據已有研究報道，木霉對人參銹腐菌等引發的人參根部病害有較好的防治效果[13]。丁萬隆等[14]研究發現，木霉菌劑可顯著降低西洋參立枯病的發病率。本實驗結果表明，人參病原菌受到木霉菌抑制后有明顯的生長停滯甚至萎縮現象，據已知木霉菌生防機制，推測可能是木霉菌生長速度快，對病原菌形成營養和空間的雙重競爭，使病原菌因缺乏營養和空間而萎縮；另外也可能是木霉對病菌菌絲得重寄生作用，導致病菌菌絲生長的抑制作用。

對于本實驗篩選出的7株拮抗菌對四種人參致病菌均有較強的抑菌活性，證明其在人參病害生物防治領域有較大的應用潛力。后續將深入探索上述菌株對人參致病菌的抑菌作用機理，結合田間病害防效測定，為人參病害生物防治提供科學依據。

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ScreeningandIdentificationofAntagonisticStrainsagainstPhytopathogensofPanaxginseng

SHAO Tianwei, DING Wanlong, LI Yong*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China)

Objective：To screen strains that having antagonistic activity againstCylindrocarpondestructans，Alternariapanaxetc.，providing references for biocontrol of soilborne diseases prevailing inP.ginseng.Methods：Strains were separated from ginseng-cultivating soils and commercial microbial agents by the plate dilution method.Confronting culture method was used to screen antagonistic strains against pathogens ofP.ginseng.Antagonistic agents were identified by 16S and 28S ribosomal DNA sequencing.Results：In total，66 stains were isolated from ginseng cultivating soil.Among them，strain X shown significant antagonistic activity against pathogens ofP.ginseng.Another 17 stains were isolated from commercial microbial pesticides，in which strains QM，BM2，HZ3，GG，HC and DD had antagonistic activity against pathogens ofP.ginseng.Homology results showed that，strain X was identified asB.amyloliquefaciens，QM，BM2 and HZ3 wasBacillusmethylotrophicus，GG wasB.subtilis，HC wasTrichodermaasperellumand DD wasT.effusum.Conclusion：Seven strains having antagonistic activity against pathogens ofP.ginsengwere identified.Strain X can be used to develop microbial pesticide，while commercial agents corresponding to QM，BM2，HZ3，GG，HC and DD can be used directly to control soil-borne diseases ofP.ginseng.

Panaxginseng；diseases；antagonists；screen；identification

中醫藥行業科研專項(201407005)；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程(2016-I2M-3-017)

] 李勇，研究員，研究方向：藥用植物病害生物防治技術研究；E-mail：liyong@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.020

2016-11-22)

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