紅外光譜結(jié)合聚類分析法快速鑒別不同加工方式肉蓯蓉△

王夏，孫素琴，徐榮*，彭芳，徐常青，劉同寧，陳君*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 瀕危藥材繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.清華大學(xué) 化學(xué)系，北京 100084；3.寧夏回族自治區(qū)永寧縣本草蓯蓉種植基地，寧夏 銀川 750010)

·基礎(chǔ)研究·

紅外光譜結(jié)合聚類分析法快速鑒別不同加工方式肉蓯蓉△

王夏1，孫素琴2，徐榮1*，彭芳1，徐常青1，劉同寧3，陳君1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 瀕危藥材繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.清華大學(xué) 化學(xué)系，北京 100084；3.寧夏回族自治區(qū)永寧縣本草蓯蓉種植基地，寧夏 銀川 750010)

目的：利用傅里葉變換紅外光譜結(jié)合聚類分析法對不同加工方式肉蓯蓉的宏觀差異進(jìn)行分析，為名貴瀕危中藥肉蓯蓉加工方式的鑒別和選擇提供方法和依據(jù)。方法：通過采用帶有全反射衰減附件(ATR)的紅外光譜儀，在4000～650 cm-1波段內(nèi)檢測3種整株加工和5種不同切片加工方式處理的180個(gè)肉蓯蓉樣品粉末，得到紅外光譜圖，圖譜通過ATR校正及預(yù)處理后，應(yīng)用AssureID軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：以識別率和拒絕率為指標(biāo)判斷聚類結(jié)果，當(dāng)兩個(gè)值都越大時(shí)，表明這兩類物質(zhì)之間沒有重疊，可以較好地將其聚類然后分開。整株加工和切片加工的藥材樣品分別聚類，結(jié)果顯示整株加工的肉蓯蓉樣品中，3種加工方式的識別率和拒絕率最高值均達(dá)到100%，最低值為76%；切片加工的肉蓯蓉樣品中，識別率最高達(dá)100%，拒絕率最低為72%。結(jié)論：紅外光譜結(jié)合聚類分析不僅能有效區(qū)分不同加工方式的肉蓯蓉樣品，并且能佐證產(chǎn)地加工對藥材成分變化的影響，為加工炮制藥材的快速鑒別和質(zhì)量控制提供了方法。

紅外光譜；肉蓯蓉；加工方式；聚類分析

肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma為列當(dāng)科(Orobanchaceae)肉蓯蓉屬(CistancheHoffmg.et Link)多年生寄生性草本植物，有“沙漠人參”之美譽(yù)，以干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖入藥，具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便等功效，是我國西北荒漠地區(qū)特有的名貴補(bǔ)益類中藥材[1]。經(jīng)過十幾年的研究，國內(nèi)已初步形成了以西北為中心的肉蓯蓉種植區(qū)域，內(nèi)蒙古、新疆、寧夏和甘肅等省區(qū)先后建設(shè)了多個(gè)具有一定規(guī)模的肉蓯蓉種植基地。隨著藥材產(chǎn)量的提高，產(chǎn)地加工已成為各種植基地面臨的首要問題。產(chǎn)地加工是中藥生產(chǎn)的第一步，是中藥品質(zhì)形成的重要影響因素。已有研究表明不同加工方式對肉蓯蓉藥材質(zhì)量影響顯著[2-5]。目前應(yīng)用傳統(tǒng)分析方法對不同加工方式肉蓯蓉成分差異的研究較多[4-5]，傳統(tǒng)分析方法需對樣品進(jìn)行分離提取，前處理繁瑣，耗時(shí)長，不適合大批量樣品快速鑒別；而不同加工方式的肉蓯蓉藥材成分差異較小，并且大多成分僅為量的差異，因此，業(yè)內(nèi)缺乏對不同加工方式藥材的無損鑒別和快速評價(jià)方法。

傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR)技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、樣品用量少、無需提取分離、儀器操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，而且具有宏觀性、整體性及無損快速等特點(diǎn)，適用于鑒定中藥材等復(fù)雜混合體系。紅外光譜可以全面反映中藥的復(fù)雜成分特征，對樣品進(jìn)行多層次、多指標(biāo)分析。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，高分辨、高光通量并且具有優(yōu)良信噪比的紅外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合進(jìn)行中藥材的模式識別，日益成為一種快速鑒別中藥材的有效途徑，在各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，如復(fù)雜混合物的分析鑒定[6-7]、活體細(xì)胞的損傷監(jiān)控[8]、藥用動(dòng)植物產(chǎn)地和真?zhèn)蝺?yōu)劣的快速鑒別[9-11]、中藥材不同部位的成分分析和比較[12-13]等。

本研究首次利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結(jié)合AssureID軟件對不同加工方式肉蓯蓉進(jìn)行聚類分析，為瀕危中藥資源肉蓯蓉產(chǎn)地加工藥材提供了一種簡單易行的快速鑒別方法，同時(shí)也為肉蓯蓉產(chǎn)地加工方式的選擇提供依據(jù)，可有效保障肉蓯蓉資源的合理開發(fā)和利用。

1 儀器與材料

1.1儀器

SpectrumOne傅立葉變換紅外光譜儀、衰減全反射附件(ATR)、紅外DTGS檢測器(PerkinElmer公司)；BJ-150粉碎機(jī)(德清拜杰電器公司)；XQM-0.4L型球磨儀(南京大冉科技有限公司)。

1.2材料

實(shí)驗(yàn)原材料選自寧夏肉蓯蓉基地2013年春季采收的新鮮肉蓯蓉藥材，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳君教授鑒定為肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma。選取完整、無明顯蟲蛀的肉蓯蓉，統(tǒng)一用自來水沖去泥沙，將表面多余水分自然晾干。整株加工樣品：分為3個(gè)處理組，處理方法及樣本量見表1。切片加工樣品：將新鮮肉蓯蓉切成0.3cm厚度的鮮肉蓯蓉片，分為5個(gè)處理組，處理方法及樣本量見表2。所有樣品干燥后用粉碎機(jī)和球磨儀粉碎，過200目篩，備測。

表1 肉蓯蓉整株樣品列表及處理方法

表2 肉蓯蓉切片樣品列表及處理方法

2 圖譜采集和數(shù)據(jù)處理方法

紅外圖譜采集和處理應(yīng)用SpectrumV10.0操作軟件；聚類分析采用PerkinElmer公司研發(fā)的AssureID軟件。

整株肉蓯蓉樣品和切片肉蓯蓉樣品均運(yùn)用ATR附件進(jìn)行掃描，ATR附件的全反射晶體為ZnSe，采用單次全反射測量方式，入射角度為45°。掃描條件：掃描16次(背景采集掃描32次)，光譜分辨率4 cm-1，測量范圍4000～400 cm-1，衰減全反射壓力常數(shù)為100。將肉蓯蓉粉末鋪到ATR附件樣品臺上，進(jìn)行紅外光譜掃描，獲得紅外光譜圖，其中每個(gè)樣品測定3次，求出平均光譜，進(jìn)行ATR校正結(jié)合基線修正進(jìn)行圖譜處理(三者前后對比見圖1)，ATR法掃描和透射法掃描獲取的光譜因原理不同，縱軸及橫軸的數(shù)值有一定差別。所以，通過對ATR光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)男Ｕ扇〉酶硐氲慕Y(jié)果。

圖1 肉蓯蓉樣品紅外光譜原圖譜、ATR校正、基線修正前后對比圖

3 結(jié)果與討論

3.1不同加工方式整株肉蓯蓉的聚類分析

對于不同加工方式的整株肉蓯蓉樣品，采用AssureID軟件對紅外圖譜進(jìn)行聚類分析，通過識別率(Recognitionrate)和拒絕率(Rejectionrate)進(jìn)行了分析與評價(jià)(識別率即模型對屬于該類未知樣品的接受程度，即某類樣品有多少落在該類模型的區(qū)域內(nèi)；拒絕率即模型對于其他不屬于該類未知樣品的拒絕程度，某類樣品模型對于其他不屬于該類的未知樣品的拒絕程度。當(dāng)兩個(gè)值都為100%時(shí)，表明這兩類物質(zhì)之間沒有重疊，可以較好地將其分開)。識別率和拒絕率反映的是所建聚類模型的可信度，3種整株加工方式的藥材粉末的識別率和拒絕率如表3所示。

表3 不同加工方式整株肉蓯蓉識別率和拒絕率

由表3可以明顯看出，直接曬干組樣品的識別率和拒絕率分別為100%和76%，直接陰干組分別為100%和76%，蒸制曬干組分別為94%和100%；以識別率和拒絕率為指標(biāo)，可以有效區(qū)分直接陰干組、直接曬干組、蒸制曬干組樣品。

以任一加工方式的樣品集合為橫坐標(biāo)，另外一個(gè)加工方式的樣品集合為縱坐標(biāo)，做出3種加工方式的類模型圖，結(jié)果如圖2所示(每一個(gè)橢圓區(qū)內(nèi)為同一生育期的樣本)。本類模型圖顯示，兩兩集合之間無重疊或者僅有少量重疊，可較好地鑒別開，結(jié)果較為理想。隨著樣本量持續(xù)增加，聚類效果會(huì)更加明顯。

圖2 不同整株加工方式肉蓯蓉類模型圖

3.2不同加工方式切片肉蓯蓉的聚類分析

同3.1的數(shù)據(jù)分析方法，5種切片加工方式的藥材粉末的識別率和拒絕率如表4所示。

由表4可以明顯看出，水焯處理組的識別率和拒絕率分別是97%和72%，烘箱直接干燥組分別為100%和99%，冷凍干燥組分別為100%和90%，微波處理組分別為100%和81%，蒸氣處理組分別為97%和88%。同樣，以識別率和拒絕率為指標(biāo)，可有效區(qū)分這5種切片加工方式的肉蓯蓉樣品。

表4 不同加工方式切片肉蓯蓉識別率和拒絕率

同3.1，以任一加工方式的樣品集合為橫坐標(biāo)，另外一個(gè)加工方式的樣品集合為縱坐標(biāo)，做出5種切片加工方式的類模型圖，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以直觀看出，不同切片加工方式的樣品兩兩比較，均可較好地鑒別開。類模型圖中距離越遠(yuǎn)的兩種加工方式的樣品其成分差異也越大，如水焯組C與冷凍組L、烘箱組H的距離均較遠(yuǎn)，它們之間成分差異也較大。

圖3 不同加工方式切片肉蓯蓉的類模型圖

4 結(jié)論和討論

本課題組前期通過文獻(xiàn)檢索和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同加工方式對肉蓯蓉主要成分松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、多糖和醇溶性浸出物的含量影響顯著[4-5]，但這些檢測分析均建立在復(fù)雜的前處理和儀器分離基礎(chǔ)上，目前缺乏對不同加工方式藥材的宏觀分析和快速鑒別研究。本研究通過ATR紅外光譜聚類分析，佐證了產(chǎn)地加工對藥材成分變化的影響程度，以拒絕率和識別率為指標(biāo)，聚類分析能夠快速準(zhǔn)確地把不同加工方式的肉蓯蓉樣品區(qū)分開來，類模型圖也可以直觀表明聚類的結(jié)果較為理想，說明采用傅里葉變換紅外光譜結(jié)合聚類分析法應(yīng)用于不同加工方式的鑒別是可行和有效的。同時(shí)，本研究也為中藥粉末的快速分析和鑒別提供了一種直觀簡便的手段。在實(shí)驗(yàn)過程中，與傳統(tǒng)化學(xué)分析方法相比，紅外光譜操作簡便，需樣量少，無需對樣品進(jìn)行分離提取，避免了化學(xué)試劑對人體和環(huán)境的毒害，綠色環(huán)保。

以往紅外光譜聚類分析大多采用KBr壓片法進(jìn)行[9-15]，本文采用ATR附件對肉蓯蓉進(jìn)行光譜采集，減少了KBr壓片過程的人為誤差，更加省時(shí)、省力、方便、快捷。此外，以往與紅外光譜結(jié)合的聚類分析多應(yīng)用Spectrum Quant +軟件[14-15]，AssureID軟件同樣采用SIMCA聚類法；但是相比較原方法，AssureID軟件單純作為一個(gè)聚類軟件，更加簡明，操作簡單。

目前應(yīng)用紅外光譜和聚類分析法進(jìn)行藥材真?zhèn)舞b別以及不同部位和產(chǎn)地比較的研究論文較多[12-13]，而對于不同加工方式藥材的鑒別研究鮮有報(bào)道。由于不同加工方式的肉蓯蓉差異相對較小，本研究中某些處理間的識別率和拒絕率相對較低，如整株肉蓯蓉樣品中，直接曬干處理和直接陰干處理的拒絕率僅為76%；切片肉蓯蓉樣品中，水焯處理的拒絕率僅為72%。今后研究中還需要引入其他圖譜處理軟件和矯正方法，建立一個(gè)更加準(zhǔn)確和適合的聚類模型。

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IdentificationofCistanchedeserticolawithDifferentProcessingMethodbyFTIRandClusteringAnalysis

WANG Xia1，SUN Suqin2，XU Rong1*，PENG Fang1，XU Changqing1，LIU Tongning3，CHEN Jun1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China；2.DepartmentofChemistry,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China；3.NingxiaPlantationofCistanchesHerba,Yinchuan750100,China)

Objective：Inorder to provide basis for the identification and selection of theprocessing methods ofCistanchedeserticola，F(xiàn)ourier transform infrared spectroscopy (FTIR) combined with clustering analysis method was applied toidentifyC.deserticolasamples with different processing methods.Methods：By using the FTIR with attenuated total reflection(ATR) accessories，180 samples from the whole plants or slices ofC.deserticolathat went through diverse processing methodswere detected，and the infrared spectrographs in 4000-650 cm-1waveband were obtained.The spectrographs were corrected using ATR correction，and then clustering analyzed by Assure ID software.Results：The recognition rate and rejection rate are used as two judging criteria for clustering results.When the two rateswere bigger，it indicated that themodel performed more discrimination efficiency.As revealed by respectiveclustering，samples from both whole-plant processions and slice processions were at high values in these two rates.Thus，we could identify them through the method mentioned above.Conclusion：Infrared spectroscopy combined with clustering analysis can not only distinguish samples ofC.deserticolawith different processing methods，but provide a basis for nondestructive identification and rapid evaluation ofother medicinal materials.

Fourier transform infrared spectroscopy；Cistanchedeserticola；processing method；clustering analysis

國家自然科學(xué)基金(U1403224；81102748)；國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI05B03)；寧夏回族自治區(qū)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(YKX-12)

] 徐榮，副研究員，研究方向：藥用植物栽培與保護(hù)；Tel：(010)57833180，E-mail：rxu@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.013

2016-10-08)

*[