基于ITS2序列的維吾爾藥材神香草鑒定研究△

楊珺，樊叢照，李曉瑾*

(1.昌吉職業技術學院藥學院，新疆 昌吉 831100；2.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所 國家中醫藥管理局新疆中藥民族藥資源重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830002)

·基礎研究·

基于ITS2序列的維吾爾藥材神香草鑒定研究△

楊珺1，樊叢照2，李曉瑾2*

(1.昌吉職業技術學院藥學院，新疆 昌吉 831100；2.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所 國家中醫藥管理局新疆中藥民族藥資源重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830002)

目的：采用DNA條形碼技術建立維吾爾藥材神香草鑒別的方法。方法：使用DNA條形碼ITS2序列，建立了維吾爾藥材神香草基原植物DNA條形碼ITS2序列標準數據庫，對市售11份“神香草”藥材進行鑒定。結果：市售神香草藥材僅有2份為維吾爾藥材標準中收錄的硬尖神香草，1份為神香草屬植物，1份為鼠尾草屬植物，其余7份來源于荊芥屬植物。結論：DNA條形碼ITS2序列可作為鑒定維吾爾藥材神香草及其偽品藥材的有效工具。

神香草；ITS2；鑒定；DNA條形碼

維吾爾常用藥材神香草，維吾爾語名“祖帕”，維吾爾藥材標準中記載其基原植物為唇形科(Lamiaceae)多年生草本植物硬尖神香草H.cuspidatus，其全草均可入藥，維醫廣泛用其治療氣管炎的咳嗽、氣喘、感冒發燒和風濕等病證[1-4]。目前硬尖神香草多為野生，由于資源短缺，使市場供應不足而出現混淆品，主要為大苞荊芥Nepetabracteata[5]。大苞荊芥維吾爾語名亦為“祖帕”，易與硬尖神香草混淆，但其化學成分，藥性及作用功效與硬尖神香草存在顯著差異[6-7]，誤用會危害患者的生命健康。針對市場上出現的混淆品，已有研究者采用性狀、顯微及理化鑒別等方法對硬尖神香草與大苞荊芥進行了鑒定[5]，雖然為維吾爾藥材神香草的質量控制提供了一定的依據，但這些鑒定方法需要很強的專業性，不適于推廣應用。

相比之下，DNA條形碼技術[8]能夠實現快速、準確和自動化的物種鑒定，適用于非專業工作者。2011年，中國植物條形碼工作組(Chinese Plant BOL Group)建議將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心DNA條形碼[9]。ITS2序列作為藥材鑒別的DNA條形碼，已被載入《中華人民共和國藥典》2010版第三增補本[10]和2015版[11]，在常用中藥民族藥材紅景天[12]、枸杞[13]、蜀葵[14]等藥材真偽鑒別中得到驗證。

1 材料與方法

1.1實驗材料

此研究中所使用的16份神香草屬植物樣本采自新疆不同地區，包括11份硬尖神香草及5份大花神香草，由新疆中藥民族藥研究所副研究員王果平鑒定，憑證標本保存于新疆中藥民族藥研究所標本館(新疆XTNM)；自市場收集11份“神香草”藥材樣品。神香草基原植物樣本ITS2單倍型序列已提交至GenBank(表1)。

表1 實驗材料信息

1.2試劑

PCR擴增所用引物由生工生物工程合成，ITS2正向序列：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；DNA提取試劑盒(DP305-03)、DNA聚合酶及dNTP等均購自天根生物(TIANGEN)。

1.3實驗儀器

實驗所使用的DNA提取研磨儀為GRINDER，型號GT-100；離心機為上海安亭科學儀器，型號AnkerTGL-16C；PCR擴增儀為AnAnalytikJenacompany，型號070-851。

1.4方法

1.4.1DNA提取及檢測 稱取干燥藥材(枝葉)30mg，DNA提取研磨儀1000r·min-1研磨2min，植物DNA提取試劑盒提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質量。

1.4.2PCR擴增及測序 反應體積25μL，dNTP0.4μL(10mmol·L-1)，PCR緩沖液2.5μL(10×)，引物各1.0μL(2.5μmol·L-1)，聚合酶1.0U，總DNA1μL(約30ng)。引物ITS2擴增程序：94℃，變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s(40個循環)；72℃延伸10min[15]。PCR擴增產物經瓊脂糖電泳檢測并純化后，使用ABI3730XL(AppliedBiosystemsCo.，USA)測序儀由美吉生物測序公司進行雙向測序。

1.5數據處理

測序峰圖用CodonCodeAlignerV4.0.4(CodonCodeCo.，USA)校對拼接，去除引物區。將所有序列由軟件MEGA5.0(molecularevolutionarygeneticsanalysis)分析比對[16]，ITS2序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除兩端5.8S和28S區段獲得ITS2間隔區序列[17]，用鄰接(NJ)構建系統聚類樹，使用bootstrap(1000次重復)檢驗各分支的支持率[18]。

1.6BLAST鑒定

將測序獲得的藥材樣本序列在GenBank數據庫(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)進行BLAST鑒定，搜索相似性最高的植物序列。

2 結果

2.1序列信息分析

ITS2序列分析結果顯示，硬尖神香草為2個單倍型，長度均為219bp，GC含量變化為68.0%～68.5%；大花神香草單倍型數為2，長度為219bp，GC含量為68.0%；11個藥材樣本有7個單倍型，其中編號為YC130006、YC130008、YC130011為同一單倍型，編號YC130007與YC130010序列一致，YC130005與YC130009一致。

表2 ITS2序列信息

2.2種內及種間變異位點分析

16份植物樣本中，硬尖神香草種內存在1個變異位點，為187bp位點的A-C變異，大花神香草種內有2個變異位點，分別為164bp位點的C-T變異及187bp位點的A-C變異，硬尖神香草與大花神香草種間差異不顯著。在7個單倍型的神香草藥材序列中，編號為YC130001的藥材與硬尖神香草相似，編號為YC130009的藥材序列與硬尖神香草一致，其余序列均與硬尖神香草之間變異較大。

2.3ITS2序列BLAST鑒定結果

11條藥材序列GenBank數據庫BLAST結果如表3所示，僅編號為YC130001、YC130005及YC130009的藥材與神香草屬植物序列相似度較高，其中標號為YC130005及YC130009的藥材與硬尖神香草一致，判定為正品藥材，編號為YC130001的藥材來源于神香草屬其他植物。編號為YC130004的藥材來源于鼠尾草屬植物，其余7份藥材均來源于荊芥屬植物。

2.4神香草屬植物及藥材NJ樹鑒定結果

基于硬尖神香草、大花神香草及藥材單倍型序列構建NJ鑒別樹，結果如圖2所示，僅編號為YC130001及YC130009的藥材與硬尖神香草及同屬植物聚在一起，支持率為99%；編號為YC130002、YC130003、YC130006及YC130007的藥材聚為一支；YC130004的藥材單獨為一支。

圖1 不同單倍型實驗樣本種內及種間變異位點比較

藥材編號相似度最高植物拉丁名相似度最高植物GenBank登錄號中文名相似度(%)YC130001H.cuspidatusKF454217神香草屬植物95YC130002NepetabinaloudensisAJ515311荊芥屬的一種92YC130003NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種93YC130004SalviadaghestanicaKU563878鼠尾草屬的一種89YC130005H.cuspidatusKF454217硬尖神香草100YC130006NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種94YC130007NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種93YC130008NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種94YC130009H.cuspidatusKF454217硬尖神香草100YC130010NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種94YC130011NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種94

圖2 基于ITS2序列的單倍型NJ鑒別樹，在圖中顯示分支支持率(≥50%，bootstrap 1000次重復)

3 討論

本研究首次采用DNA條形碼技術對市售維吾爾藥材“神香草”進行鑒定，與以往的鑒定方法相比，DNA條形碼鑒定不需要樣本性狀完整，僅需要微量的入藥部位即可。研究結果表明，從維吾爾藥材“神香草”藥用部位枝葉中可成功提取基因組DNA，其DNA質量可滿足DNA條形碼鑒定的需求。

本研究以多途徑來源的硬尖神香草及大花神香草植物ITS2序列建立了鑒定數據庫，將市售藥材中獲得的ITS2序列與鑒定數據庫比對，雖然NJ樹鑒定結果顯示，編號為YC130001及YC130009的藥材均與硬尖神香草基原植物聚在一起，但NJ樹并不能完全鑒定植物種，進一步BLAST鑒定結果表明，編號為YC130009的藥材來源于硬尖神香草，編號為YC130001的藥材來源于神香草屬其他植物；大花神香草由于其資源分布有限，作為藥材的可能性較小。

在GenBank中經過BLAST對比，11份藥材樣品中有7份與荊芥屬植物相似度較高，因此推測此7份藥材可能為報道的大苞荊芥，大苞荊芥維吾爾語名為祖帕，與神香草維語同名，使得神香草藥材來源混亂，市場偽品及混淆品數量多。此外，編號為YC130004的藥材經比對與鼠尾草屬植物，可由此判斷市場上存在使用鼠尾草屬植物充當神香草的現象。

DNA條形碼在已經在植物分類及草藥鑒定等諸多領域廣泛的應用[19-22]，本文將DNA條形碼應用到維吾爾藥材鑒定領域，應用此技術成功鑒定出市售藥材神香草的真偽，隨著研究的深入，相信DNA條形碼技術會不斷應用于其他維吾爾藥材鑒定領域，為維吾爾藥材的真偽鑒別提供一個可靠的技術手段，以保障藥材的正確性，保護使用者的利益，同時有利于藥材監管部門對進出口維吾爾藥材進行監測。

[1] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥品標準·維藥分冊[S].烏魯木齊：新疆科技衛生出版社，1999：78.

[2] 新疆維吾爾自治區食品藥品監督管理局.新疆維吾爾自治區中藥維吾爾藥飲片炮制規范[S].烏魯木齊：新疆人民衛生出版社，2010：220.

[3] 劉勇民.維吾爾藥志[M].烏魯木齊：新疆科技衛生出版社，1999：423-429.

[4] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草:第7冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，1999：52-53.

[5] 徐芳，趙軍，譚為，等.維藥硬尖神香草與其混淆品大苞荊芥的生藥學鑒別[J].中國藥房，2012，23(35)：3321-3323.

[6] 《中國醫學百科全書》編輯委員會.中國醫學百科全書(維吾爾醫學)[M].上海：上海科學技術出版社，2005：229.

[7] 阿提坎木·瓦合甫，熱娜·卡斯木，叢媛媛，等.神香草與大苞荊芥體外抗氧化活性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2014,20(5)：106.

[8] Kress W J，Wurdack K J，Zimmer E A，et al.Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(23)：8369-8374.

[9] De-Zhu L，Lian-Ming G，Hong-Tao L，et al.Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011，108(49)：19641-19646.

[10]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部·第三增補本[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：92-94.

[11]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：383-384.

[12]Tianyi Xin，Xiaojin Li，Shilin Chen，et al.Survey of commercial Rhodiola products revealed species diversity and potential safety issues[J].Scientific reports，2015，5：8337.

[13]T.Y.Xin，H.Yao，S.L.Chen et al.Super food Lycium barbarum (Solanaceae) traceability via an internal transcribed spacer 2 barcode[J].Food Research International，2013,54:1699-1704.

[14]樊叢照，坤肚子·阿依，李曉瑾.基于ITS2序列的維吾爾藥材蜀葵及其近緣種鑒定研究[J].中國現代中藥，2016，18(10)：1077-1081.

[15]陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定[M].北京：人民衛生出版社，2012：14.

[16]Tamura K.，Peterson D.，Peterson N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol，2011，28(10)：2731-2739.

[17]Keller A，Schleicher T，Schultz J，et al.5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation[J].Gene，2009，430(1)：50-57.

[18]Koetschan C，Hackl T，Müller T，et al.ITS2 Database IV：Interactive taxon sampling for internal transcribed spacer 2 based phylogenies[J].Mol Phylogenet Evol，2012，63(3)：585-588.

[19]Stoeckle MY，Gamble CC，Kirpekar R.，et al.Commercial teas highlight plant DNA barcode identification successes and obstacles[J].Sci.Rep.2011，1(7):42.

[20]Newmaster S.G.，Grguric M.，Shanmughanandhan D.，et al.DNA barcoding detects contamination and substitution in North American herbal products[J].BMC Med.，2013，11:222.

[21]Kool A，de Boer H J，Martin G.，et al.Molecular identification of commercialized medicinal plants in southern Morocco[J].PLoS ONE，2012:e39459.

[22]Di Pinto A.，Di Pinto P.，Terio V.，et al.DNA barcoding for detecting market substitution in salted cod fillets and battered cod chunks[J].Food Chem.2013，141(3)：1757-1762.

StudyonOriginPlantofUygurMedicineHyssopuscuspidatusBasedonITS2Sequence

YANG Jun1，FAN Congzhao2，LI Xiaojin2*

(1.ChangjivocationalandtechnicalcollegeofPharmacy，Changji，831100China；2.XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthnicalMateria，StateAdministrationoftraditionalChinesemedicineKeyLaboratoryoftraditionalChinesemedicineandethnicmedicineresources，Urumqi830002，China)

Objective：To establish a method for identification of identify the origin plant of Uygur medicineHyssopuscuspidatusby DNA barcode technology.Methods：DNA barcode ITS2 sequence was used to establish a standard database ofH.cuspidatus，and eleven medicinal materials “H.cuspidatus” were authenticated by the identification system.Results：Only two medicinal materials were fromH.cuspidatus，one of them was fromHyssopusgenus，and one was fromSalviagenus，the other 7 samples were fromNepetagenus.Conclusion：ITS2 sequence can be used as an effective barcode to identify Uygur MedicineH.cuspidatusfrom its adulterants.

Hyssopuscuspidatus；ITS2；identification；DNA barcode

新疆維吾爾自治區科技廳高新技術研究發展項目(201517107)

] 李曉瑾，研究員，研究方向：中藥資源；Tel：(0991)2665614，E-mail：xjlxj@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.006

2017-02-28)

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