滇皖產區鐵皮石斛居群SSR分子身份證的構建△

董曉曼，袁媛，查良平，彭代銀，俞年軍，王繼永，趙玉洋，蔣超，黃璐琦

(1.道地藥材國家重點實驗室培育基地，中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700；2.安徽中醫藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫藥科學院 中藥資源保護與開發研究所，安徽 合肥 230012；4.中國中藥公司，北京 100195)

·基礎研究·

滇皖產區鐵皮石斛居群SSR分子身份證的構建△

董曉曼1，2，袁媛1*，查良平2，3，彭代銀2，3，俞年軍2，王繼永4，趙玉洋1，蔣超1*，黃璐琦1

(1.道地藥材國家重點實驗室培育基地，中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700；2.安徽中醫藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫藥科學院 中藥資源保護與開發研究所，安徽 合肥 230012；4.中國中藥公司，北京 100195)

目的：建立滇皖產區鐵皮石斛SSR指紋圖譜，并構建不同居群的SSR分子身份證。方法：使用生物信息學方法分析鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)全基因組SSR(Simple sequence repeat)序列，獲得SSR位點，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物并進行PCR擴增，選擇高多態性引物進行遺傳多樣性分析并建立SSR指紋圖譜代碼，使用二維碼生成器表述鐵皮石斛居群的分子身份證。結果：共獲得91 653個SSR位點，平均分布距離為15.44 kb。據此開發了75對SSR引物，篩選出32對多態性豐富、帶型清晰的引物，對11個滇、皖產區的鐵皮石斛居群進行遺傳多樣性分析，共得到117個多態信息位點，平均每個SSR引物多態信息含量(PIC)為0.62，變化范圍為0.22～0.80；鐵皮石斛不同居群進行親緣關系聚類表明11個鐵皮石斛居群可分為三支，與種質來源分布相一致。篩選出4對多態性高、帶型清晰易于統計的引物組合，建立不同居群鐵皮石斛的SSR指紋圖譜庫和不同居群的分子身份證。結論：SSR分子身份證可為今后鐵皮石斛的品種鑒別提供準確、可靠的方法和溯源信息平臺。

鐵皮石斛；基因組SSR；分子身份證

鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo是我國傳統名貴中藥，自2010年起已作為單一品種收錄于《中華人民共和國藥典》[1]。近年來，由于鐵皮石斛野生資源衰竭和種植、加工技術的突破，人工栽培鐵皮石斛已占據主導地位。鐵皮石斛自然分布范圍廣[2]，生境差異大，種內變異多，其栽培品種種源復雜，變異類型廣泛。不同栽培品種的鐵皮石斛中氨基酸、多糖及微量元素等含量具有明顯差異[3-4]，市場上鐵皮石斛產量和質量良莠不齊，嚴重制約了安全、優質和高產鐵皮石斛藥材的可持續生產。由于各企業均采用組織培養和快繁技術，頻繁繼代易導致體細胞無性系變異，即使同一品種也存在株間變異，品種內形態差異較大[5]，且傳統的形態學鑒定也很難對種子、幼苗進行品種鑒定。急需建立鐵皮石斛不同栽培變異類型的特異性分子標記，為其栽培引種、生產、流通過程以及產品的追溯和司法仲裁提供技術支撐。

分子身份證(molecular ID，mID)是一種基于DNA電泳圖譜的分子代碼，通過將品種分子特征數字化后以字符串的形式輸出，使結果更加簡單明了，包含信息更加全面[6]。分子身份證既能夠鑒別生物個體差異，又能檢測生物種質特征，已被廣泛應用于農作物和果蔬的種質分型、純度鑒定與種源追溯等[7-9]。由于簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)多態性豐富、具共顯性、重現性好、在染色體上分布均勻[10]，已廣泛用于SSR指紋圖譜和種質資源分子身份證的構建。

本研究擬利用SSR技術，對云南和安徽地區的11個栽培鐵皮石斛居群進行多態性分析，并篩選出重復性高、條帶清晰易統計的引物構建鐵皮石斛的SSR指紋圖譜和分子身份證，為鐵皮石斛分子身份證數據庫的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

研究材料取自云南省紅河市綠春縣、安徽省宣城市涇縣和六安市霍山縣的栽培基地，共188個樣品，經安徽中醫藥大學俞年軍教授鑒定為鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo，憑證標本保存于安徽中醫藥大學藥園，詳細信息見表1。

1.2DNA提取

樣品采集后硅膠干燥，取20～100mg，使用兩步CTAB法[11]提取樣品總DNA，并進行DNA濃度和純度測定，調整終濃度約為50 ng·μL-1用于進一步研究。1.3基因組SSR篩選鐵皮石斛全基因組數據來自Liang等的文獻[12]。使用SSR搜索程序(http：//www.gramene.org/db/markers/ssrtool)搜索已獲得的鐵皮石斛基因組序列中潛在的2～6bp的SSR，參數設置為：二核苷酸重復≥14bp，三核苷酸重復≥18bp，四、五核苷酸重復≥20bp，六核苷酸重復≥18bp。

表1 鐵皮石斛樣品信息表

1.4SSR引物設計

依據SSR側翼區域序列，應用引物設計軟件Primer Premier5.0設計引物。引物設計的原則為：引物長18～25bp， PCR產物長100～250bp，GC含量為40%～60%。引物經BLAST比對，根據結果重點對3′端堿基及上下游引物間隔進行調整，最大限度保證引物3′端堿基與擴增位點相匹配，以及有效擴增長度[13]，設計75對引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5PCR擴增及銀染檢測

PCR反應在ABI公司的9700型PCR擴增儀上進行。PCR反應體系(25μL)為：2.5μL10×PCR buffer，2μL2.5mmol·L-1dNTPs，10μmol·L-1引物各1μL，2.5U rTaq酶[寶生物工程(大連)有限公司]，1μL DNA模板。反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性40s，52～60℃復性50s，72℃延伸50s，40個循環；72℃延伸10min。產物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測[14]。

1.6數據處理

擴增條帶在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，用Excel軟件統計整理。利用Popgene32軟件計算SSR位點的等位基因數(Numberofalleles，Na)、有效等位基因數(Effectivenumberofalleles，Ne)、Nei’s基因多樣性指數(Nei’sgenediversity) 、Shannon多樣性指數(Shannon’sinformationindex) 和Nei’s遺傳相似性系數和遺傳距離；用PICCalc軟件分析位點多態信息含量(Polymorphisminformationcontent，PIC)，PIC計算公式為PIC=1-∑fi2，其中fi為i位點基因頻率；并基于非加權組平均法(UnweightedPairGroupMethodwithArithmeticMean，UPGMA)算法對11個居群所有個體進行聚類分析。

1.7指紋圖譜構建

參考指紋圖譜代碼構建方法[15]，將挑選的多態性引物按照多態性降序排列，編號為A、B、C……每對SSR引物擴增的多態性條帶依據分子量由大到小排列設編號為a、b、c……如樣品經引物GD92263擴增后有a、c處條帶，無b處條帶，則記錄為101。記錄每份材料經不同SSR引物擴增出現的條帶，則每個居群的樣品經不同引物擴增后將會形成由字母和阿拉伯數字組成的一系列帶型編號，便形成了該居群的SSR指紋圖譜代碼。

1.8鐵皮石斛居群分子身份證建立

結合鐵皮石斛不同居群的SSR指紋圖譜和樣品采集地信息等，構建11個鐵皮石斛居群的分子身份證，并利用在線QR二維碼生成器(http：//tool.oschina.net/qr)以條碼表述構建的鐵皮石斛居群的身份證。

2 結果與分析

2.1鐵皮石斛SSR發掘和特征分析

鐵皮石斛基因組1.35Gb，共784830條無冗余的基因組序列，按照設置參數共檢索到91653個SSR位點。平均距離為15.44kb，即基因組序列上每15.44kb出現一個SSR位點。在所搜索到的SSR中，二核苷酸重復類型占比例最高(63.97%)，三核苷酸重復類型所占比例為26.27%，四、五、六核苷酸重復單元類型所占比例均較低，分別為3.50%、4.72% 和1.54%(見表2)。其中二核苷酸出現頻率為六核苷酸出現頻率的41.5倍，與忍冬[16]、鳶尾[17]、人參[18]等的研究結果相符，但在部分松屬物種[19]中獲得的SSR序列以三核苷酸重復為主，這種占優勢的重復類型可能與測序方式、篩選SSR參數[16]及待測物種有關。

表2 鐵皮石斛SSR分布及類型

在各重復類型中，不同重復基元出現的頻率也有差異。二核苷酸重復類型中各基元所占比例依次為：AT/TA(24.90%)>AG/CT(18.86%)>TC/GA(15.89%)>AC/GT(3.64%)>TG/CA(1.97%)>CG/GC(0.02%) (見圖1)，表現出AT優勢，與丹參[20]、巧家五針松[21]、思茅松[22]的SSR分析結果相一致。鐵皮石斛基因組存在少量CG/GC重復，有研究認為[23]GC重復類型較少是因為基因組DNA中的CpG甲基化，很容易通過脫氨基作用轉變為胸腺嘧啶。也有研究[24]指出物種中的GC重復都是較少的，并進一步認為可能與GC重復所形成的DNA結構有關。三核苷酸重復類型共檢索出59種，其中AAT/ATT較多(5.75%)，其次是ACA/TGT(4.98%)，TAA/TTA(4.25%)，ATA/TAT(3.36%)，TTG/CAA(1.65%)和AAG/CTT(1.13%)，未見ACG重復基元，其余47種重復類型均較少。

圖1 二核苷酸重復SSR和三核苷酸重復SSR基序類型分析

2.2鐵皮石斛SSR引物設計及篩選

利用75對引物初步擴增了每個居群中隨機選取的鐵皮石斛共11份樣品，

選出擴增良好、帶型清晰、且具有多態性的引物32對(見表3)，利用多態性引物對11個居群樣品基因組DNA進行SSR-PCR擴增，共檢測到132個條帶，其中多態性條帶為117條，每對引物可以檢測到2～7條數目不等的多態性條帶，平均可檢測到4條。每對引物擴增出3～14個等位基因，平均每對引物擴增出7.6個等位基因。每對引物擴增的有效等位基因數為2.4～12，平均每對引物為6.3個。Nei’s基因多樣性系數變化范圍為0.0551～0.4298，平均為0.3158，有18對引物均高于均值水平；Shannon多樣性指數變化范圍為0.1015～0.6193，平均為0.4535，有19對引物高于均值水平。

32對SSR引物的多態信息含量平均值為0.62，按照Bostein[25]的理論，其中有26對引物具高度多態性(PIC>0.5)，5對具中度多態性(0.25

表3 SSR引物序列信息及多態性情況

表3(續)

注：F.正向引物；R.反向引物；PIC.位點多態信息含量；Na.等位基因數；Ne.有效等位基因數；H.Nei’s 遺傳多樣性；I.Shannon’s 指數。

2.3基于SSR的遺傳多樣性分析

根據32對SSR引物擴增形成的帶型多樣性，對11個供試的鐵皮石斛居群進行了遺傳相似系數計算和聚類分析(見圖2)。結果表明，11個鐵皮石斛居群的遺傳相似系數范圍在0.1121～0.8939，平均遺傳相似系數為0.5444。在此基礎上，對鐵皮石斛不同居群進行親緣關系聚類，11個鐵皮石斛居群可分為三支，第I支包含了于安徽省涇縣采集的YSTP和JXTP2個居群，其中YSTP為涇縣當地野生鐵皮石斛，JXTP為YSTP引種栽培的居群，二者親緣關系較近；第II支包含了由云南采集的HGTP、HJC、YGTP和YZTP4個居群，均為云南本地品種；而第III支除了由安徽六安采集的ZJTP、ZKTP和HSTP，還包含由云南采集的QGTP和XGTP共5個居群，其中ZJTP、ZKTP和HSTP均為安徽品種，而QGTP和XGTP種質均來源于浙江，地理位置與安徽接近。結果表明，基于SSR多態性的聚類與居群地理種源顯著相關，鐵皮石斛種內地理位置相近的居群遺傳基礎相對接近，與丁鴿[26]、苑鶴[27]等對鐵皮石斛野生和栽培居群的遺傳多樣性研究相一致。

圖2 基于32對引物的滇皖鐵皮石斛UPGMA聚類樹

2.4基于SSR構建鐵皮石斛主產區居群的分子身份證

從32對多態性引物中挑選重復性好、擴增條帶清晰易辨的4對引物，按PIC值降序排列為XJ89800(A)，GD92263(B)，FJS58122(C)和GD80011(D)進行組合，對鐵皮石斛樣品進行擴增后，每居群特征電泳圖譜見圖3；依據設計的指紋圖譜構建方法，為每一居群建立了唯一能夠區別于其他供試材料的指紋圖譜代碼，見表4。

利用在線二維碼生成器對所有鐵皮石斛居群進行QR編碼，為每個居群構建了分子身份證(見圖4)，其中包含了居群名稱、物種、SSR指紋圖譜和采集地。如圖4中YSTP包含“居群名：YSTP；物種：鐵皮石斛Dendrobiumofficinale；SSR指紋圖譜：A01110B1000C1111D10；栽培地地理信息：安徽省涇縣，北緯：30°43′40″，東經：118°32′26″，海拔：200m；種源地：安徽省涇縣”信息。

注：泳道1～11分別為YSTP、JXTP、HGTP、YZTP、QGTP、YGTP、HJC、HSTP、ZJTP、ZKTP和XGTP居群。圖3 滇皖產區鐵皮石斛典型SSR指紋圖譜

序號居群SSR指紋1YSTPA01110B1000C1111D102JXTPA11100B1000C0001D003HGTPA11110B1111C1111D114YZTPA01111B1100C1101D105QGTPA01111B1111C1111D106YGTPA01111B1111C1111D117HJCA01111B0111C1111D018HSTPA00111B1001C1101D119ZJTPA10111B1111C1101D1110ZKTPA10101B1111C1111D1111XGTPA01111B0111C0001D10

注：A～D.引物XJ89800、GD92263、FJS58122及GD80011。

圖4 滇皖產區11個鐵皮石斛居群分子身份證二維條碼

3 討論與結論

遺傳多樣性是種質資源保護和開發的重要依據，篩選等位變異大的SSR位點對揭示遺傳多樣性方面有重要的研究價值。與EST-SSR相比，基因組SSR變異更豐富，遺傳多樣性更高[28-30]，適合種內及居群間親緣關系、分子系統學與遺傳多樣性研究[31-32]。本研究使用基因組SSR對不同鐵皮石斛居群進行遺傳多樣性研究，其平均等位基因數、平均有效等位基因數、位點平均多態信息含量均較高，表明本研究中的鐵皮石斛居群遺傳多樣性水平較高。11個鐵皮石斛居群可聚為三大支，與種質來源而非采集地聯系緊密，種質資源地理位置相近的鐵皮石斛其遺傳關系較近，同時也體現了當今鐵皮石斛種質資源相互交流、引進越來越頻繁。

鐵皮石斛種質鑒定多基于形態學描述，受環境、生長周期等影響，耗時且難以對種子、幼苗進行準確鑒別。基于SSR的分子指紋圖譜和分子身份證被認為是品種鑒定理想的標記之一[33]，通過構建指紋圖譜庫和分子身份證，可對鐵皮石斛種質、品種乃至個體進行準確鑒定。另一方面，二維碼的普及為中藥的鑒定與溯源提供了直接的硬件支持[34-35]，由于SSR是一種基于條帶有無的判定方式，可以直接轉換為二維條碼而不改變分子指紋圖譜的內容，且可添加照片、形態、性狀描述、居群、地理信息以方便核對，通過對分子身份證掃描二維條碼進行真偽、種質和產地溯源，用于中藥流通監管的各個環節，實現數字化監管。

分子身份證的核心是準確、易區分的指紋圖譜庫。完善的指紋圖譜庫的構建應全面且具有代表性，不僅需要供試材料來源廣泛，對引物的選擇也有一定標準。在多態性高的前提下，擴增條帶重復性高，清晰易統計也應納入考慮范圍，故而隨著種質資源數的擴大，所選用的SSR引物也將不斷調整和優化，最終建立囊括所有核心種質的分子身份證。而居群內的個體突變和人工種植中的機械混雜導致的種質混雜等，同一品種鐵皮石斛的不同個體在DNA分子水平可能存在微弱差異，表現為同居群不同個體經同一SSR引物擴增后產物位點數不同，可根據中華中醫藥學會團體標準“T/CACM 010-2016 中藥分子鑒定通則”的要求根據樣品間差異位點數進行判定。

本研究利用32對多態性引物進行11份鐵皮石斛居群的遺傳多樣性分析，并從中篩選4對多態性好、分辨率高的SSR引物建立各鐵皮石斛居群唯一的SSR指紋圖譜，結合栽培基地地理位置等信息，以構建鐵皮石斛居群的分子身份證，旨在為今后鐵皮石斛的品種鑒定提供準確、可靠的方法及溯源信息平臺。

致謝：感謝安徽霍山長沖中藥材開發有限公司何祥林總經理在樣品采集中提供的幫助！

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MolecularIDforPopulationsofDendrobiumofficinaleofYunnanandAnhuiProvinceBasedonSSRMarker

DONG Xiaoman1，2，YUAN Yuan1*，ZHA Liangping2，3，PENG Daiyin2，3，YU Nianjun2，WANG Jiyong4，ZHAO Yuyang1，JIANG Chao1*，HUANG Luqi1

(1.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsBreedingBase，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；2.SchoolofPharmacy，AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei230012，China；3.InstituteofConservationandDevelopmentofTraditionalChineseMedicineResources，AnhuiAcademyofChineseMedicine，Hefei230012，China；4.ChineseTraditionalMedicineCompanyofChina，Beijing100195，China)

Objective：To establish a molecular ID(mID)forDendrobiumofficinalerigin from Yunnan and Anhui.Methods：Genome ofD.officinalewas analyzed and SSRs (Simple Sequence Repeats) were isolated.Primers were designed by Primer Premier 5.0 software，high polymorphism primers were isolated and genetic diversity analysis was performed，and thenSSR fingerprinting database and mIDs of 11 populations ofD.officinalewere constructed.Results：A total of 91 653 SSRs were isolated，the average distribution density was 15.44 kb.75 pairs of SSR primers were designed and screened，32 high polymorphismprimer pairs were selected to generate polymorphic fingerprints.The results showed that the 32 pairs of primers could generate 117 polymorphic alleles bands.The average polymorphism information content (PIC)as 0.62 with a range of 0.22-0.80.11 populations ofD.officinalecould be clustered to 3 branches，which accordance with the geographical distribution of its germplasm.Fingerprinting database of 11 populations ofD.officinalewere established with 4 pairs of primers，and in consequence the molecular ID were established for the 11 populations.Conclusion：SSR marker is suitable for construction of DNA fingerprinting database ofD.officinaleand the database could provide reference for population identification ofD.officinale.

Dendrobiumofficinale；genomic SSR；molecular ID

中醫藥行業科研專項(201407003)；國家杰出青年科學基金項目(81325023)

] 蔣超，助理研究員，研究方向：中藥分子鑒定，E-mail：jiangchao0411@126.com；袁媛，研究員，研究方向：中藥資源與分子生藥學；E-mail：y_yuan0732@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.005

2017-03-22)

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