傣百解體外細胞毒活性評價及其化學成分預實驗△

李曉花，李海濤，金玲鈺，牛迎鳳，張麗霞

(西雙版納州傣藥南藥重點實驗室，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

·基礎(chǔ)研究·

傣百解體外細胞毒活性評價及其化學成分預實驗△

李曉花，李海濤，金玲鈺，牛迎鳳，張麗霞*

(西雙版納州傣藥南藥重點實驗室，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

目的：研究傣百解不同溶劑提取物和不同萃取部位的體外抗腫瘤細胞增殖活性，探索活性部位的化學成分。方法：分別以水、50%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液3種溶劑對傣百解進行回流提取，采用系統(tǒng)溶劑法對傣百解95%乙醇水溶液提取物進行萃取，采用SRB法測定不同濃度提取物和萃取部位對人胃癌細胞SGC7901、人肝癌細胞HepG2、人宮頸癌細胞Hela、人卵巢癌細胞SKOV3和人胰腺癌細胞SW1990 5種腫瘤細胞增殖的影響；采用試管法、紙反應法等，對傣百解活性部位的化學成分進行初步研究。結(jié)果：傣百解抗腫瘤活性部位為乙酸乙酯萃取部位，對SGC7901、HepG2、Hela和SKOV3腫瘤細胞增殖的IC50分別為8.5、20、18.2、12.2 μg·mL-1。乙酸乙酯部位可能含有甾體皂苷、揮發(fā)油和有機酸等化學成分。結(jié)論：傣百解95%乙醇水溶液提取物的乙酸乙酯萃取部位具有廣譜細胞毒活性，化學成分以甾體皂苷為主。

傣百解；細胞毒；預實驗

據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，癌癥是全世界一個主要死亡原因[1]。國家癌癥中心發(fā)布的《2015中國腫瘤登記年報》統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國每年新增癌癥病例約350萬，約有250萬人因此死亡[2]。中藥和民族藥是我國傳統(tǒng)藥的兩個重要組成部分，在我國應用歷史悠久，具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應的作用特點。從傳統(tǒng)藥物中開發(fā)應用于腫瘤等疾病的藥物，與化學藥物相比，具有不良反應少、不易產(chǎn)生抗藥性、有效緩解患者的痛苦、干預性好等優(yōu)點[3-4]。

傣百解的原植物是蘿藦科牛奶菜屬植物通光散Marsdeniatenacissima(Roxh.)Moon，但《中國植物志》和《Flora of China》中收載的通光散的描述和插圖有誤，與傣百解的基原植物是不同種[5]。傣百解傣語稱“雅解先打”，意為解百毒的藥，在我國西雙版納、德宏等地，以及老撾、緬甸等國家的傣族居住區(qū)使用極其廣泛[6]。傣百解以根入藥，性涼、味苦，入火、土、風塔，具有清火解毒、消腫止痛之功效，常用于咽喉腫痛、口舌生瘡、療瘍斑疹、肺熱咳嗽、胃脘痛、尿痛、解藥食毒；還可用于清除因飲食不潔、用藥不當而致的各種不良反應。傣百解為國藥準字品種“雅解片”的主要組方中藥，同時也是西雙版納傣醫(yī)院多個院內(nèi)制劑如百解膠囊、版納涼劑、雅解嘎罕等的組方中藥[7]。傣百解臨床用于多種腫瘤的治療，因此，本文對傣百解不同溶劑提取物及不同萃取部位進行體外抗腫瘤活性篩選，明確傣百解的活性部位，并對其化學成分類型進行鑒別，以期明確傣百解體外細胞毒活性部位、對不同腫瘤細胞的選擇抑制活性和可能的活性成分。

1 材料與儀器

1.1 細胞株

人胃癌細胞SGC7901、人肝癌細胞HepG2、人宮頸癌細胞Hela、人卵巢癌細胞SKOV3和人胰腺癌細胞SW1990(中科院上海細胞庫)。

1.2 儀器

CA-1390-1型超凈工作臺(上海凈化設(shè)備有限公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma Scientific(Marietta，OH，United States)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；BT 124S型十萬分之一天平(Sartorius公司)；SPECTRA MAX 190酶標儀(Molecular Devices(Sunnyvale CA，USA)。

1.3 試劑與藥材

RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；SRB(Sigma-Aldrich，St Louis，Mo，USA)；二甲基亞砜[生工生物工程(上海)股份有限公司]；胎牛血清(FBS；Gaithersburg，USA)；胰蛋白酶(美國Amresco公司)；甲醇、乙醇等分析純試劑(天津大茂化學試劑廠)；顯色劑均為實驗室自配；陽性對照藥：消癌平片(陜西科學院制藥廠，批號：140225)，紫杉醇(大連美倫生物，批號：A0818A)。

植物材料于2014年3月采自云南西雙版納州，經(jīng)本所張麗霞副研究員鑒定為通光散Marsdeniatenacissima(Roxh.)Moon，材料經(jīng)過粉碎成粗粉后備用。原標本保存于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所云南分所標本館(D20100720008)。

2 方法

2.1 傣百解的提取和萃取

2.1.1 不同溶劑提取物的制備 稱取傣百解根粉3份，每份50 g，分別加入10倍量的95%乙醇、50%乙醇水溶液和水回流提取3 h，提取液冷卻后過濾，減壓濃縮，得到95%乙醇水溶液提取物(DBJ-1)、50%乙醇水溶液提取物(DBJ-2)和水提取物(DBJ-3)。以上提取物用于體外抗腫瘤活性試驗，明確傣百解的最佳提取溶劑。

2.1.2 95%乙醇水溶液提取物的制備及萃取 傣百解粉末適量，加入10倍量95%乙醇水溶液浸潤，回流提取2 h，減壓濃縮，得到提取物。提取物用適量蒸餾水混懸后，依次用等量乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部位(DBJ-4)、正丁醇部位(DBJ-5)和水部位(DBJ-6)。各極性部位進行體外細胞毒活性試驗，明確傣百解具有細胞毒活性的部位。

2.3 實驗分組

正常對照組：培養(yǎng)細胞不加藥物處理，只加培養(yǎng)液。給藥組：分9個劑量組，在培養(yǎng)液中加入傣百解提取物，藥液終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1、3、10、33、100、333、1000 μg·mL-1。陽性對照組：培養(yǎng)液中加入含 0.1、0.3、1、3、10、33、100、333、1000 μg·mL-1的陽性對照藥。

2.4 SRB法檢測不同提取物及極性部位對5種腫瘤細胞增殖的影響

細胞以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細胞一直處于對數(shù)生長期。細胞接種于96孔培養(yǎng)板，密度1～5×104個·mL-1。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h，藥物設(shè)10個濃度，每個濃度設(shè)3個復孔，連續(xù)作用72 h。藥物作用結(jié)束后，用三氯乙酸(TCA)固定細胞，清洗后加入SRB工作液，洗滌，用Tris base溶解與蛋白結(jié)合的SRB，SPECTRAmax 190細胞標儀565nm波長下測定每個小孔的吸光度(A)值，空白對照孔加20 μL培養(yǎng)液。根據(jù)A值，按公式(1)計算細胞生長抑制率[8]。

抑制率(%)=(A對照—A用藥)/A對照×100%

用 Graphpad Prism5 軟件處理，計算出化合物的 IC50值。

2.5 活性部位化學成分預實驗

活性部位用適量乙醇或甲醇溶解，過濾，得到的濾液采用試管法和紙反應法檢查黃酮、蒽醌、香豆素、萜、甾體、強心苷、有機酸、酚等類成分[9]。

3 結(jié)果

3.1 傣百解不同提取物和萃取部位體外細胞毒活性

各提取物和95%乙醇水溶液提取物的各極性萃取部位的體外細胞毒IC50計算結(jié)果見表1，作用48 h后抑制腫瘤細胞增殖效果見圖1。

表1 傣百解不同提取物和萃取部位體外細胞毒活性

由以上實驗結(jié)果可知，傣百解最佳提取溶劑為95%乙醇水溶液，活性部位為95%乙醇水溶液提取物的乙酸乙酯萃取部位。體外細胞毒活性顯示，DBJ-4對5種腫瘤細胞株中的4種具有顯著抑制作用，作用于HepG2、SGC7901、Hela和SKOV3腫瘤細胞株的IC50分別為20、8.5、18.2、12.2 μg·mL-1。

3.2 DBJ-4化學成分預實驗結(jié)果

采用試管法、濾紙片法等檢測方法，觀察實驗現(xiàn)象，推測傣百解活性部位中可能存在的化學成分類型，結(jié)果顯示，DBJ-4中可能含有甾體皂苷、有機酸和強心苷類化合物。

4 討論

傣百解為傣族傳統(tǒng)用藥，臨床應用廣泛，但缺少對傣百解藥效物質(zhì)和藥理學等的相關(guān)研究。

體外細胞毒活性實驗結(jié)果表明，各提取物和萃取部位對人胰腺癌細胞SW1990均不顯示抑制活性。3種不同溶劑提取物中，傣百解95%乙醇水溶液提取物的體外抗腫瘤活性優(yōu)于50%乙醇水溶液提取物和水提取物，抑制作用強弱順序依次為胃癌SGC7901>宮頸癌Hela>肝癌HepG2>卵巢癌SKOV3，IC50分別為55、56、65、122 μg·mL-1；乙酸乙酯萃取部位抑制作用強弱順序為胃癌SGC7901>卵巢癌SKOV3>宮頸癌Hela>肝癌HepG2，IC50分別為8.5、12.2、18.2、20 μg·mL-1。水提取物、正丁醇部位和水部位對腫瘤細胞增殖無抑制作用。由實驗結(jié)果可知，傣百解的活性部位具有廣譜細胞毒活性。

綜上表明，95%乙醇水溶液為傣百解最佳提取溶劑；提取物的乙酸乙酯萃取部位為其活性部位。化學成分預實驗表明，傣百解中可能含有甾體皂苷、揮發(fā)油和有機酸成分，其中主要成分可能是甾體皂苷。根據(jù)文獻報道[10]，甾體皂苷具有抗腫瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用和重要的生物活性。蘿藦科植物中的主要化學成分為C21甾體皂苷，具有抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲、調(diào)節(jié)免疫功能、抗生育、抗癲癇、抗氧化和抑制乙酰膽堿酯酶等活性。由此推測，傣藥傣百解臨床用于腫瘤治療的有效物質(zhì)可能為其中含有的甾體皂苷類成分。項目組將繼續(xù)對傣百解活性部位的化學成分、抗腫瘤活性和作用機制進行研究，進一步闡明傣百解抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。

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InvitroCytotoxicityActivityandPreliminaryTestforChemicalComponentsfrom“Dai-Bai-Jie”(Marsdeniatenacissima)

LIXiaohua，LIHaitao，JINLingyu，NIUYingfeng，ZHANGLixia*

(KeyLaboratoryofDaiandSouthernmedicineofXishuangbannaDaiAutonomousPrefecture，YunnanBranchInstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，Jinghong，Yunnan666100，China)

Objective：To explore the cytotoxicity activity of different solvent extracts and fractions from “Dai-Bai-Jie”(Marsdeniatenacissima)，and identify the chemical components of activity fractions.Methods：“Dai-Bai-Jie” was extracted by water，50% ethanol-aqueous and 95% ethanol-aqueous by reflux method.95% ethanol-aqueous extract were extracted by ethyl acetate andn-butyl alcohol successively.The proliferation of SGC7901，HepG2，Hela，SKOV3 and SW1990 were detected by SRB method，and components of active fraction were studied by tube reaction and paper reaction methods.Results：Ethyl acetate extract was the active fraction，and the IC50were 8.5，20，18.2 and 12.2 μg·mL-1in SGC7901，HepG2，Hela，SKOV3 tumor cells.Steroidal saponins，volatile oil and organic acid may be existed in “Dai-Bai-Jie”.Conclusion：“Dai-Bai-Jie” has broad-spectrum cytotoxicity activity，and the main chemical components are steroidal saponins.

“Dai-Bai-Jie”；cytotoxicity activity；preliminary test

景洪市科技三項費(2303-6140524)；中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務專項基金(YZYN-15-01)

] 張麗霞，碩士，副研究員，研究方向：熱帶藥用植物種質(zhì)資源保護；E-mail：87050233@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.012

2016-06-29)

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