三種增溶劑對冠心寧注射液中蛋白質檢測的影響△

李響明，張浩軍，馮玉康，孫勝斌，姜國志

(1.神威藥業集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省中藥注射液工程技術研究中心，河北 石家莊 051430；3.中藥注射劑新藥技術開發國家地方聯合工程實驗室，河北 石家莊 051430)

·中藥工業·

三種增溶劑對冠心寧注射液中蛋白質檢測的影響△

李響明1*，張浩軍1，馮玉康1*，孫勝斌2，姜國志3

(1.神威藥業集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省中藥注射液工程技術研究中心，河北 石家莊 051430；3.中藥注射劑新藥技術開發國家地方聯合工程實驗室，河北 石家莊 051430)

目的：比較3種增溶劑對冠心寧注射液中有關物質蛋白質檢測的影響。方法：分別使用泊洛沙姆188(Kolliphor P188)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(Kolliphor RH40)、15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯(Kolliphor HS15)3種輔料制備冠心寧注射液，進行有關物質蛋白質的檢測。結果：其中Poluoshamu 188、Kolliphor RH40對冠心寧注射液蛋白質檢測無影響，而含Kolliphor HS15輔料的冠心寧注射液檢測蛋白質時易出現假陽性。結論：3種增溶劑對冠心寧注射液蛋白質的檢測影響不同；按影響程度由大到小依次是Kolliphor HS15>Poluoshamu 188=Kolliphor RH40。

冠心寧注射液；Poloxamer 188；Kolliphor RH40；Kolliphor HS15；蛋白質檢查

中藥注射劑特別是復方制劑，在生產過程中受溫度、滅菌時間、pH值等工藝的變化影響，或在貯存期間受外界條件(如光線、溫度、空氣等)的影響，可能出現變色、渾濁、沉淀等現象，因此生產難度大，易造成經濟損失，影響臨床使用，可能導致嚴重不良反應等。因此，增加難溶性成分的溶解度及穩定性成為中藥注射劑質量研究的焦點[1-2]。近年來國際上新開發的藥用輔料聚山梨酯80、泊洛沙姆188、聚氧乙烯氫化蓖麻油、15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯，目前被認為是低毒、安全的藥物增溶劑，也是近幾年來頗受重視的注射用輔料。不同的增溶劑除增溶效果不同外，很可能在其他方面表現出差異。陳翔宇等[3]在進行冠心寧注射液蛋白質的研究中已發現常用增溶劑聚山梨酯80對有關物質蛋白質的檢測有干擾，易出現假陽性結果。目前尚無冠心寧注射液使用其他增溶劑的文獻報道。將Poloxamer 188、Kolliphor RH40、Kolliphor HS15 3種增溶劑應用于冠心寧注射液中，探索3種輔料在冠心寧注射液中的適用性。本研究重點對比3種增溶劑對冠心寧注射液蛋白質檢測的影響，其他方面的影響研究另文論述。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

METTLER-ALC-210.4電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)；Five-Easy實驗室PH計(上海梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

冠心寧注射液中間體總混液(神威藥業集團有限公司)；泊洛沙姆188(Kolliphor P188，北京鳳禮精求商貿有限責任公司，藥用輔料，批號：WPC1514B)；聚氧乙烯氫化蓖麻油(Kolliphor RH40)(北京鳳禮精求商貿有限責任公司，藥用輔料，批號：60187888Q0)；15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯(Kolliphor HS15，德國BASF公司，藥用輔料，批號：4330792400)；亞硫酸氫鈉(湖南爾康，藥用輔料)；依地酸二鈉(湖南爾康，藥用輔料)；磺基水楊酸(分析純)。

2 方法

2.1 蛋白質檢查方法

取本品1 mL，加新配置的30%磺基水楊酸試液1 mL，混勻，放置5 min，不得出現渾濁[4-5]。

2.2 預實驗

冠心寧注射液由丹參、川芎經水提取后，再采用醇沉、水沉結合的方式除去雜質，達到精制目的，其生產工藝復雜。在開展3種增溶劑對冠心寧注射液蛋白質檢查的影響研究前，首先將冠心寧總混液稀釋至成品藥液濃度，檢查蛋白質，確認冠心寧總混液已經滿足中藥注射劑對蛋白質的要求。制劑中除添加增溶劑外還有抗氧劑亞硫酸氫鈉、金屬絡合劑依地酸二鈉。陳翔宇等[3]的研究中已明確抗氧劑、金屬絡合劑對蛋白質檢測無影響，故本次研究不再進行確認。Poloxamer 188等首次引入該品種，使用前需確定增溶劑對蛋白質檢測有無干擾。按表1開展預實驗。

2.3 不同濃度增溶劑用量的樣品制備

取一定量冠心寧總混液，加入處方量的抗氧劑和金屬絡合劑，按表2分別加入一定量增溶劑后，加注射液用水至全量，調節pH值，制備成冠心寧注射液，備用。

表1 預實驗及結果

注：在冠心寧總混液中加入抗氧劑、絡合劑后為混合液；“+”：藥液配制時添加該物質；“-”：藥液配制時未添加該物質。

表2 3種增溶劑用量對冠心寧注射液蛋白質檢查結果的影響

注：“+”：溶液渾濁；“+”越多則越渾濁；“-”：溶液澄清。

2.4 磺基水楊酸溶液用量與蛋白質檢測結果的關系考察

近幾年曾有文獻報道，2010版《中華人民共和國藥典》檢查中藥注射劑有關物質蛋白質的方法存在不適宜性，其中郭青、祖金玥等的研究也證實了這一點[6-7]。為了明確本研究中使用的3種新增溶劑對蛋白質檢查有無影響，實驗中30%磺基水楊酸試液采取緩慢加入的方式，并考察了水楊酸溶液用量對蛋白質檢查現象的影響。

2.5 藥液pH值對蛋白質檢查的影響

冠心寧注射液配制時需調節pH值，可能藥液pH值環境與不同增溶劑的樣品在蛋白質檢查過程中有一定影響，所以本研究將藥液pH值調至多個不同值，分別檢查蛋白質。

2.6 藥液濃度水平與增溶劑用量的關系

當藥液所含濃度不同，即所含物質水平不同時，需要的增溶劑用量也可能不同，而增溶劑的用量很可能影響蛋白質的檢查結果。所以本研究開展了不同水平的藥液濃度與增溶劑最小用量之間的實驗，即在保證對蛋白質檢查無影響的前提下，摸索找出不同的藥液濃度下的最小增溶劑用量。用總固體量代表不同含量水平的藥液，按表3開展實驗。

表3 不同藥液濃度的最小增溶劑用量 %

3 結果

3.1 預實驗結果

冠心寧總混液蛋白質檢查顯示陰性，排除原料本身蛋白質陽性的可能，可應用于本次研究。Poloxamer 188、RH40、HS15三輔料增溶劑對冠心寧注射液蛋白質檢查無干擾，結果見表1，可用于后期實驗。

3.2 3種增溶劑用量與蛋白質檢測的結果

增溶劑RH40、Poloxamer 188用量在0.2%～1.0%時，冠心寧注射液蛋白質檢查均合格，而HS15的用量與蛋白質檢查結果表現出相關性，用量在0.2%～0.6%，蛋白質檢查不合格；增加用量至0.8%～1.0%時，蛋白質檢查合格。結果見表2。

3.3 30%磺基水楊酸試液用量與蛋白質檢測結果的關系

含RH40、Poloxamer 188增溶劑的樣品，剛滴入30%磺基水楊酸試液時，立即出現白色渾濁；然后隨試液的加入量增多，渾濁度增大；繼續滴加，很快出現澄清層、渾濁層(分層明顯)；試液加至1 mL后，搖勻，溶液澄清，靜置5 min后，溶液仍澄清。而含HS15增溶劑的樣品蛋白質檢查時的現象則不同。HS15用量在0.2%%～0.6%時，試液加入過程中溶液始終處于渾濁，靜置5 min后仍渾濁，但改變30%磺基水楊酸試液用量時(注射液與30%磺基水楊酸試液1∶1.2～1∶1.5)，假陽性消失，而真陽性樣品的渾濁不隨30%磺基水楊酸試液的用量增加而消失；HS15用量0.8%的樣品，檢測蛋白質時先出現渾濁，約加入0.6 mL后開始出現澄清層，加至1 mL后搖勻，溶液稍顯渾濁，靜置5 min后溶液澄清；用量1%的樣品蛋白質檢查的現象與含RH40、Poloxamer 188增溶劑的樣品基本一致。

3.4 藥液pH值對蛋白質檢測的影響

對含RH40、Poloxamer 188增溶劑的不同pH值的冠心寧注射液藥液檢查蛋白質，均呈陰性，無差異；而含HS15的藥液在pH值5.5～5.7范圍內蛋白質檢查有輕微渾濁，其他pH值的藥液蛋白質檢查呈陰性。

3.5 藥液濃度水平與增溶劑用量間的關系

以藥液中固含物的量表示藥液的濃度水平，蛋白質檢查結果顯示，當藥液濃度相對較高時，只有提高HS15的用量，才能保證對蛋白質檢查無干擾，結果見表3。對蛋白質檢查無干擾的前提下，冠心寧注射液的固含物高低與RH40、Poloxamer 188的用量無相關性，而與HS15用量呈線性相關。

4 討論

因《中華人民共和國藥典》中有關物質蛋白質的磺基水楊酸比濁法專屬性不強[6-7]，不同增溶劑對冠心寧注射液蛋白質檢查的影響不同，特別是不同的增溶劑用量可能出現相反的結果。因此中藥注射液增溶劑的選擇需慎重考慮，需加強產品的物質基礎研究。建議在未添加輔料前的中間體產品中增加蛋白質的檢測，確認精制工藝能滿足中藥注射液對有關物質蛋白質的要求。

聚氧乙烯氫化蓖麻油被廣泛用于增溶劑、乳化劑等。泊洛沙姆188具有無毒、無抗原性、無致敏性、無刺激性、不溶血等特點，化學性質穩定，有較好安全性，目前已作為西藥靜脈給藥的乳化劑和增溶劑，應用于臨床[8]。但用于中藥注射劑效果如何目前尚無相關研究。聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯(SolutolHS15)是一種新型結晶抑制劑、增溶劑，目前已收錄在德國藥典。前期研究認為，該增溶劑具有較高的增溶能力、低溶血性、低組胺釋放等優點，因此是一種高效安全的新型注射藥物增溶劑。

雖泊洛沙姆188已被2015年版《中國人民共和國藥典》收錄，但泊洛沙姆188、聚氧乙烯氫化蓖麻油、15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯近年來只在少數中藥注射液中開展了的探索性的研究[9-13]，尚未廣泛使用。且使用增溶性輔料的制劑安全性研究相對較少[14-17]，因此需在了解制劑物質基礎的同時結合劑型的特點開展相應的安全性研究，謹慎添加，為臨床用藥的安全提供保障。

[1] 冉勇，冉云，劉真.7例清開靈注射液不良反應分析[J].藥物與臨床，2009，18(2)：81-82.

[2] 張婷，朱婷婷.不同賦形劑對黃芩苷溶液穩定性的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2004，15(3)：192-193.

[3] 陳翔宇，孫勝斌，李響明，等，冠心寧注射液蛋白質檢查假陽性問題的研究[J].中國現代中藥，2015，17(11)：1212-1215.

[4] 國家食品藥品監督管理局.冠心寧注射液質量標準：WS3-B-3267-98-2012[S].2012.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[6] 郭青，吳曉燕.中藥注射劑中蛋白質檢查藥典方法的假陽性原因探究[J].中國藥品準，2011，12(3)：219-223.

[7] 祖金玥，馮孟鑫，王小紅，等.聚山梨酯80對藥典方法檢查中藥注射劑蛋白的影響[J].中國藥品標準，2015，16(1)：36-38.

[8] 王猛，張鈞壽，周建平.注射用輔料泊洛沙姆188[J].藥學與臨床研究，2007，15(1)：10-13.

[9] 祁星星，李暢，孫春萌，等，一種以Kolliphor HS15為增溶劑的參麥注射液的穩定性和安全性研究[J].中國新藥雜志，2014，23(21)：2536-2541.

[10]聶飛，唐芳，趙彬，等.15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯在參麥注射液中的應用研究[J].中藥與臨床，2014，5(2)：42-44.

[11]張少峰，鄢丹，唐慧英，等，適宜于生脈注射液的增溶性輔料篩選研究[J].中藥材，2009，6(32)：969-972.

[12]郭立，楊秀榮.清開靈注射液制備工藝對增溶性輔料增溶作用的影響[J].中國醫藥指南，2011，9(26)：216-217.

[13]王偉.中藥復方開心散和香丹注射液的制劑基礎研究[D].北京：中國醫學科學院北京協和醫學院，2010.

[14]羅實.銀杏雙酯注射液的制備和質量標準研究[D].成都：四川抗菌素工業研究所，2014.

[15]張嘉，李貽奎，李連達，等.聚山梨酯80和泊洛沙姆188等4種增溶劑對小鼠的急性毒性[J].中國新藥雜質，2008，17(17)：1491-1493.

[16]易紅，高進，楊華，等，幾種注射用表面活性劑的質量標準及安全性概述[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16(1)：115-119.

[17]張海燕，韋迎春，鄔偉魁,等.3種增溶性輔料致大鼠肝腎損傷[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(20)：237-241.

EffectofThreeKindsofSolubilizersonProteinDetectioninGuanxinningInjection

LIXiangming1*ZHANGHaojun1，FENGYukang1*，SUNShengbin2，JIANGGuozhi3

(1.ShinewayPharmaceuticalGroupCo.，Ltd.，Shijiazhuang051430，China； 2.HebeiProvinceEngineeringResearchCenterforTCMInjectionShijiazhuang051430，China； 3.State-LocalJointEngineeringLaboratoryofNewDrugsDevelopmentTechnologyforTCMInjectionShijiazhuang051430，China)

Objective：To compare the effects of three excipients on Guanxinning Injection related substances determination of protein.Methods：Poloxamer 188(Kolliphor P188)，polyoxyethylene hydrogenated castor oil(Kolliphor RH40)，15-hydroxystearate，polyethylene glycol(Kolliphor HS15)，three kinds of excipients were used to prepare Guanxinning injection，the related substances protein were detected.Results：Poloxamer 188(Kolliphor P188)，polyoxyethylene hydrogenated castor oil(Kolliphor RH40)had no effect on protein detection of Guanxinning Injection，conversely Kolliphor HS15 in Guanxinning Injection resulted in false positive of protein detection.Conclusion：The effect of three kinds of solubilizers accessories in Guanxinning Injection on protein detection is different with the order of Kolliphor HS15 > Poluoshamu 188=Kolliphor RH40.

Guanxinning Injection；Poloxamer 188；Kolliphor RH40；Kolliphor HS15；protein examination

國家重大新藥創制專項(2011ZX09401-306-004)

] 馮玉康，工程師，研究方向：藥品工藝技術、質量研究及產業化研究，E-mail：fykxy_206@163.com； 李響明，助理工程師，研究方向：藥品質量及產業化研究，E-mail：li.xiangming.com@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.020

2016-04-28)

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