UPLC-MS/MS測定不同產地吊石苣苔中苯乙醇苷類成分含量△

張瑜，楊健，詹志來，胡峻，劉勇*，袁媛

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地，中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700)

·基礎研究·

UPLC-MS/MS測定不同產地吊石苣苔中苯乙醇苷類成分含量△

張瑜1，2，楊健2，詹志來2，胡峻1，劉勇1*，袁媛2

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地，中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700)

目的：建立超高效液相色譜三重四極桿串聯質譜法(UPLC-MS/MS)同時測定不同產地吊石苣苔中4個苯乙醇苷類成分的方法，分析比較不同產地吊石苣苔中苯乙醇苷含量差異。方法：采用 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)；以 0.1%甲酸-水(A)- 0.1%甲酸-乙腈(B)溶液為流動相，梯度洗脫，體積流量為 0.5 mL·min-1；柱溫為40 ℃，采用電噴霧離子源，負離子檢測方式，得到相應的提取離子流圖。結果：不同產地吊石苣苔中4個苯乙醇苷含量有明顯差異，結論：該方法操作簡便、準確、重復性好，對尋找高含量苯乙醇苷的資源植物及產地具有重要的理論指導意義。

吊石苣苔；苯乙醇苷；UPLC-MS/MS

吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.為苦苣苔科(Gesneriaceae)吊石苣苔屬(Lysionotus)草本植物，別名石豇豆、石澤蘭、巖豇豆、巖石茶、巖頭三七等[1-2]，近代研究表明其具有抗結核桿菌、抗炎、抗肝毒，祛痰、平喘鎮靜，降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、清除自由基、抗腫瘤作用和提高機體免疫功能等多種活性作用[3]，苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides)是廣泛存在于玄參目和唇形目等較進化的雙子葉植物類群(如爵床科、列當科、苦苣苔科、唇形科和馬鞭草科)中的一類活性成分，有些文獻[4]也稱苯丙素苷類化合物(phenylpropanoid glycosides)，該類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、增強記憶、保肝、強心等作用[5]。課題組前期工作表明，吊石苣苔中含有阿克苷和極為少見的paraboside Ⅲ等苯乙醇苷類成分[6]，本研究以另外4個苯乙醇苷類化合物作為對照品，以湖南、云南、四川、重慶4個產地13個吊石苣苔為實驗樣本，采用UPLC-MS/MS測定樣本中4個苯乙醇苷的含量，對探究苯乙醇苷含量較高的吊石苣苔產地分布規律有一定理論指導意義。

1 材料與儀器

1.1 材料

苯乙醇苷類對照品共4個，分別是isonuomioside A、paraboside B、nuomioside A、paraboside A，為實驗室自制，純度均大于95%。對照品化學結構見圖1。

注：1.isonuomioside A；2.paraboside B；3.nuomioside A；4.paraboside A。圖1 苯乙醇苷類化合物的化學結構

1.2 植物

2013年8月從湖南、云南、四川、重慶4個地方采集到13個吊石苣苔樣品，并由中國科學院北京植物研究所李振宇研究員鑒定為吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.。樣品標本保存于北京中醫藥大學，樣品信息見表1。

表1 吊石苣苔樣品采集信息表

1.3 儀器和試劑

ACQUITY UPLCTM H-Class系統(美國Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、EmpowerTM3色譜工作站)，API 6500四極桿-線性離子阱質譜儀(美國ABSCIEX 公司，配有離子噴霧接口)，SB-800 DTD型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，New Classic MS-S電子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]，Eppendorf 5810R離心機(德國Eppendorf 公司)。

色譜級甲醇和乙腈(美國Fisher Scientific公司)；甲酸(LC/MS分析用，美國Fisher Scientific公司)；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1mm，1.8 μm)，流動相：0.1%甲酸-水溶液(A)，0.1%甲酸-乙腈(B)；按程序梯度洗脫(0 min，15% B；1 min，20.5% B；4 min，21.5% B)；流速為0.6 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進樣量為1 μL。對照品和樣品的提取離子流圖(XIC)見圖 2、3。

注：A.nuomioside A；B.paraboside A；C.paraboside B；D.isonuomioside A。圖2 對照品提取離子流圖

2.1.2 質譜條件 離子源：Turbo V，電離模式：ESI-，氣簾氣(CUR)體積流量：30 L·min-1，噴霧電壓(IS)：-4500 V，霧化氣(GS1)體積流量：55 L·min-1，加熱輔助氣(GS2)體積流量：55 L·min-1，采集方式：MRM，離子化溫度(TEMP)：550 ℃。優化的條件參數見表2。

注：A.nuomioside A；B.paraboside A；C.paraboside B；D.isonuomioside A。圖3 吊石苣苔樣品提取離子流圖

化合物tR/minMRM參數MRM離子對(m/z)去簇電壓(DP/V)碰撞能量(CE/eV)射出電壓(CXP/V)isonuomiosideA1.81609.1/160.9-198-45-14parabosideB1.75741.1/579.0-267-49-49nuomiosideA1.38609.1/160.9-199-42-19parabosideA1.33741.2/579.1-279-45-49

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取樣品細粉2.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液[6]50 mL，稱定質量，超聲處理(功率 250 W，頻率 40 kHz)1 h，稱定重量，用70%甲醇水溶液[7]補足減少的質量，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC分析用。

2.2.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取isonuomioside A、paraboside B、nuomioside A、paraboside A對照品適量，用甲醇配成單一成分對照品儲備液。精密量取上述4種對照品溶液適量，加甲醇配制成每1 mL含isonuomioside A 519.4 μg、paraboside B 392.7 μg、nuomioside A 520.4 μg、paraboside A 497.3 μg的混合對照品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC分析用。

2.3 線性關系考察

將上述混合對照品溶液進一步稀釋成6個不同質量濃度的對照品溶液，按照2.1項下色譜條件測定峰面積。以進樣質量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標分別得到回歸方程：isonuomioside A，Y=2.079 2×106X-189 010(r=0.999 6)，線性范圍0.166 ～ 259.68 μg·mL-1；paraboside B，Y=9.393 38×105X-214 846(r=0.999 4)，線性范圍0.125 ～ 39.27 μg·mL-1；nuomioside A，Y=1.426 92×106X-293 390(r=0.999 8)，線性范圍0.166～ 520.35 μg·mL-1；paraboside A，Y=9.587 86×106X-434 129(r=0.999 5)，線性范圍0.159 ～ 49.77 μg·mL-1。

2.4 精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液連續進樣6次，分別記錄4個苯乙醇苷的峰面積和保留時間，計算其RSD在1.14%～1.88%；表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

取同一樣品5份，按照2.2.1項方法制備供試品溶液，進樣測定，計算各苯乙醇苷成分質量分數的RSD值在1.77%～2.78%，表明方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗

取同一樣品供試品溶液，分別在0、1、2、3、4、6、8 h 測定4個苯乙醇苷的峰面積,并計算其RSD值在 0.78%～3.76%，表明溶液在8 h內穩定性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取吊石苣苔樣品9份，向其中加入高、中、低3個質量濃度(n=3)的對照品溶液。按照2.2項下方法處理后進樣分析，每個濃度進行3次樣本分析，以計算所得的實際值與加入量的比值即為其準確度。4個苯乙醇苷的平均加樣回收率：isonuomioside A 為103.4%，paraboside B為97.5%，nuomioside A為98.5%，paraboside A為101.8%，其 RSD 均小于 2.9%。

3 樣品測定

取13批樣品，分別按照2.2.1項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分析，以標準曲線法計算13批樣品中4個苯乙醇苷類成分的質量分數，結果見表3。

表3 吊石苣苔中苯乙醇苷類成分質量分數(n=3) μg·mL-1

4 討論

苯乙醇苷類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、增強記憶、保肝、強心等作用[5]，近年來逐步成為研究熱點，本課題組前期研究表明，該類成分廣泛存在于苦苣苔科植物中，本研究選用了4個苯乙醇苷類成分，其中isonuomioside A和paraboside B分別為咖啡酰基連在葡萄糖基6位的二糖苷和三糖苷，nuomioside A和paraboside A分別為咖啡酰基連在葡萄糖基4位的二糖苷和三糖苷；本實驗結果表明，除了湖南省安化、四川省峨眉和重慶酉陽3個產地未檢測到paraboside B，在其他產地的吊石苣苔中都檢測到了4個苯乙醇苷類成分，說明這4個苯乙醇苷在吊石苣苔中普遍存在。

從不同產地分析，四川省漢源地區的吊石苣苔苯乙醇苷含量是所有地區中最高的，其中nuomioside A和isonuomioside A的含量分別高達0.78%和0.33%，與其相比，四川省其他地區樣品中4個成分含量均較低，湖南省產的吊石苣苔從整體來看，4個苯乙醇苷含量比其他產地高，其中nuomioside A的含量均大于0.1%，isonuomioside A的含量除了湖南省安化的樣品較低，其他地區均大于0.1%，而重慶和云南采的樣品中，4個苯乙醇苷含量均較低。結果表明，不同產地吊石苣苔的苯乙醇苷含量存在較大差異。

nuomioside A和isonuomioside A在吊石苣苔中的含量表明這兩個成分是吊石苣苔中重要的化學成分，目前2015版《中華人民共和國藥典》中規定吊石苣苔的指標性成分為石吊蘭素，且含量不低于0.1%[8]，鑒于苯乙醇苷類成分具有很好的活性且其在吊石苣苔中具有很高的含量，課題組后期工作可能會考慮為吊石苣苔中的苯乙醇苷類成分制訂質量標準。

本實驗的不足之處在于有的產地采集的樣品太少，不能代表當地整體的吊石苣苔苯乙醇苷含量，今后還要進一步收集樣品進行研究。

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[2] 趙汝能.甘肅中草藥資源志：上冊[M].蘭州：甘肅科技出版社，2003：665-667.

[3] 王仕寶，晏繼紅，郭曉華，等.苗藥石吊蘭的研究進展[J].西北藥學雜志，2014，29(5)：550.

[4] 李振宇，王印政.中國苦苣苔科植物[M].鄭州：河南科學技術出版社，2004：606-607.

[5] 宋光西，馬玲云，魏鋒，等.苯乙醇苷的分布及藥理活性研究進展[J].亞太傳統醫藥，2011，7(4)：169-171.

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DeterminationofFourPhenylethanolGlycosidesinAerialPartsofLysionotuspauciflorusfromDifferentHabitatsbyUPLC-MS/MS

ZHANGYu1，2，YANGJian2，ZHANZhilai1，HUJun1，LIUYong1*，YUANYuan2

(1.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102,China；2.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsbreedingbase，NationalResourcesCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To establish a UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of four phenylethanol glycosides in the aerial parts ofLysionotuspauciflorusMaxim.，and analyze and investigate the difference of phenylethanol glycosides ingredients in samples from different habitats.Methods：The determination was performed on the ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)with0.1% formic acid-water(A)and 0.1% formic acid-acetonitrile(B)in gradient elution as mobile phase.The flow rate was 0.5 mL·min-1.The column temperature was 40 ℃.MS instrument was equipped with ESI-ion source.Gaining The extracted ion chromatograms were obtained susquently.Results：There are differences in the composition and content from different habitats.Conclusion：The developed method for the simultaneous determination of the four phenylethanol glycosides is simple，accurate，and reproducible，has great theoretical significance for looking for high levels of phenylethanol glycosides of plant resources and habitats.

Lysionotuspauciflorus；phenylethanol glycosides；UPLC-MS/MS

國家自然科學基金項目(81373959)；中醫藥行業科研專項(201407003)；北京中醫藥大學自主選題資助項目(2016-JYB-XS125)

] 劉勇，教授，研究方向：藥用植物親緣學；Tel：(010)84738656，E-mail：yliu0126@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.007

2016-07-06)

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