款冬花歐盟質量標準研究△

相婷，吳麗真，鄭璐*，周海燕

(1.揚子江藥業(yè)集團有限公司 國家中醫(yī)藥管理局中藥質量控制實驗室，江蘇 泰州 225321；2.中國中藥公司，北京 100195)

·基礎研究·

款冬花歐盟質量標準研究△

相婷1，吳麗真1，鄭璐1*，周海燕2

(1.揚子江藥業(yè)集團有限公司 國家中醫(yī)藥管理局中藥質量控制實驗室，江蘇 泰州 225321；2.中國中藥公司，北京 100195)

目的：根據(jù)《歐洲草藥植物專論研究指導原則》建立款冬花藥材的質量標準，主要包括薄層鑒別方法和含量測定方法。方法：薄層鑒別選用款冬酮作為指標成分，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開后噴以硫酸乙醇試液加熱顯色，置于紫外燈365 nm下檢視；含量測定采用YMC-Pack ODS-A色譜柱，甲醇-水為流動相，梯度洗脫，柱溫：35 ℃，流速：0.8 mL·min-1，檢測波長：220 nm。結果：薄層鑒別方法專屬性強，主成分條帶清晰，辨識度高；含量測定方法學結果表明款冬酮在3.074～153.7 μg·mL-1內(nèi)線性關系良好(r=0.999 9)，平均回收率為99.9%(RSD=2.0%)，重復性、中間精密度、穩(wěn)定性及耐用性考察RSD均小于2.0%。結論：本研究中建立的薄層色譜鑒別方法和含量測定方法可準確測定款冬花中款冬酮的含量，為《歐洲藥典》款冬花專論提供研究數(shù)據(jù)。

款冬花；歐洲藥典；款冬酮；薄層鑒別；含量測定

款冬花為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，具有潤肺下氣、止咳化痰之功效，用于治療新久咳嗽、喘咳痰多和老嗽咳血等癥[1]。款冬花中主要含有萜、黃酮和生物堿等類成分[2]。現(xiàn)代藥理學研究表明，款冬花醇提物具有明顯的鎮(zhèn)咳祛痰作用[3]；款冬酮能顯著增加外周作用，具有較強的升壓作用[4]；另有實驗證明款冬酮具有較強的抗過敏和抗炎作用[5-6]。本研究以款冬酮為指標性成分，按照《歐洲草藥植物專論研究指導原則》建立款冬花藥材的薄層鑒別方法和HPLC含量測定方法，為《歐洲藥典》款冬花專論的質量標準草案提供詳細的研究資料。

1 儀器與試藥

瑞士CAMAG薄層成像系統(tǒng)；美國安捷倫1200高效液相色譜儀(G1322A脫氣機，G1312A二元高壓泵，G1367B自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315D紫外檢測器和ChemStation色譜工作站)；KQ-250B型超聲清洗儀；瑞士梅特勒XP205DR型分析天平。

款冬酮對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111884-201102)；15批款冬花樣品購自河北安國市中藥材市場，經(jīng)中國藥科大學李會軍教授鑒定為款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，樣品信息見表1。

HPLC分析用甲醇為色譜純；TLC分析用乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷和硫酸等試劑均為分析純；純化水(杭州娃哈哈集團有限公司)；TLC分析用硅膠G板(德國默克公司，10 cm×20 cm)。

表1 15批款冬花樣品信息

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

取款冬花藥材粉末(過50目篩)約1 g，精密稱定，加20 mL乙醇，超聲1 h后過濾，濾液蒸干，殘渣溶解于1 mL乙酸乙酯中，即得供試品溶液。另取款冬酮對照品約1 mg，精密稱定后溶解于1 mL乙醇溶液中，即得對照品溶液。吸取以上供試品溶液和對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層色譜板上，條帶點樣，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1，V/V)為展開劑，展距不小于8 cm，展開后取出晾干，噴以硫酸乙醇試液顯色，置于紫外燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯示相同顏色的熒光條帶，見圖1。

注：1～8.S01～S08號樣品；9.款冬酮；10.S15；11～16.S09～S14號樣品。圖1 15批次款冬花薄層鑒別色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：YMC-Pack ODS-A(150 mm×4.0 mm，5 μm)；流動相A：水，流動相B：甲醇；按程序梯度洗脫(0～15 min，25%A；15～16 min，25%A→0%A；16～25 min，0%A)；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為35℃；檢測波長為220 nm；進樣量為10 μL。

2.2.2 制備溶液

2.2.2.1 空白溶液 乙醇溶液。

2.2.2.2 對照品溶液 取款冬酮對照品約13.0 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液1 mL，乙醇稀釋定容至25 mL，即得。2.2.2.3 供試品溶液 取款冬花藥材粉末(過50目篩)約1.000 g，精密稱定，置于具塞容量瓶中，精密加入20 mL乙醇后稱重，室溫下超聲提取1 h，冷卻后補足損失的重量，搖勻，過濾，收集續(xù)濾液，即得。2.2.2.4 空白供試品溶液 不加入款冬花藥材，按照2.2.2.3項下供試品溶液制備方法進行操作，即得。2.2.2.5 對照品供試品混合溶液 分別量取適量的供試品溶液和空白供試品溶液，1∶1等體積混合，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 按照2.2.2分別制備空白溶液、對照品溶液和供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜，見圖2。結果顯示對照品連續(xù)進樣5針，峰面積RSD=0.05%，對照品和供試品溶液中款冬酮色譜峰的對稱因子在0.95～1.05，理論塔板數(shù)均不小于6000，款冬酮色譜峰與前后雜質峰分離度均大于1.50，提示該色譜系統(tǒng)適用性良好。

注：A.空白溶液；B.款冬酮對照品溶液；C.供試品溶液。圖2 款冬花及對照品溶液HPLC圖

2.2.4 專屬性試驗 按照2.2.2項下溶液制備方法分別制備空白溶液、對照品溶液、供試品溶液、空白供試品溶液和對照品供試品混合溶液，按2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜。結果顯示空白溶液和空白供試品溶液對主色譜峰無干擾，對照品供試品混合溶液中主色譜峰峰形無裂分，提示該方法專屬性良好。

2.2.5 線性關系考察

2.2.5.1對照品線性關系考察 取款冬酮對照品約15.0 mg，精密稱定，溶解于50 mL乙醇溶液，作為母液。分別精密量取適量上述母液，稀釋配制成質量濃度為3.074、6.148、15.37、46.11、76.85、153.7 μg·mL-1的系列對照品溶液。按2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜。以質量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性擬合，得回歸方程Y=29.37X+ 0.590(r=0.999 9)。結果表明，款冬酮在3.074～153.7 μg·mL-1線性關系良好。

2.2.5.2 供試品線性關系考察 分別取款冬花藥材粉末(過50目篩)約0.20、0.40、0.60、1.00、1.50、2.00 g，精密稱定，按照2.2.2.3方法制備得到一系列不同質量分數(shù)的供試品溶液。按2.2.1項下色譜條件對以上供試品溶液進行測定，記錄色譜。以質量分數(shù)(X，%)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性擬合，得回歸方程Y=15.06X+ 7.415(r=0.999 9)。結果表明，供試品在0.202 6～2.005 1 g線性關系良好。

2.2.6 重復性試驗 分別取款冬花藥材粉末(過50目篩)約0.50、1.00、1.50 g(相當于50%、100%、150% 3個質量分數(shù)水平)各6份樣品，精密稱定。按照2.2.2.3方法制備18份供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜。結果款冬酮含量在低、中、高3個質量分數(shù)水平下RSD值分別為0.88%、0.84%、0.99%，提示該方法重復性良好。

2.2.7 中間精密度試驗 另外一名操作者取款冬花藥材粉末(過50目篩)約1.00 g，平行6份樣品，精密稱定。按照2.2.2.3方法制備6份供試品溶液。按2.2.1項下色譜條件用另外一臺高效液相色譜儀Agilent 1260進行測定，記錄色譜。結果兩名操作者在不同儀器上測得款冬酮含量的RSD值為1.28%，提示該方法中間精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 分別取2.2.2.2和2.2.2.3項下對照品和供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h時按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜。結果對照品和供試品峰面積的RSD值分別為0.12%和0.24%，提示對照品和供試品在乙醇溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收試驗 取已知含量的款冬花藥材粉末(過50目篩)約0.50 g，平行9份樣品，分為3組，分別加入3個質量分數(shù)水平(50%、100%、150%)的款冬酮對照品。按照2.2.2.3方法制備得到9份供試品溶液。按2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 款冬花中款冬酮加樣回收率試驗結果(n=9)

2.2.10 耐用性試驗 本研究中耐用性試驗是通過單變量分析法(OVAT)微調(diào)測試條件中的單個變量觀察結果的不受影響程度，改變色譜條件變量(流速、流動相比例、柱溫、檢測波長和色譜柱)，結果表明該方法耐用性良好，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 色譜條件耐用性結果

2.2.11 樣品含量測定 取14批次款冬花樣品適量，按照2.2.2.3項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進行測定，雙樣雙針，記錄色譜并計算樣品含量，結果見表4。

表4 款冬花樣品中款冬酮含量測定結果(n=2)

3 討論

3.1 薄層條件篩選與優(yōu)化

2015版《中華人民共和國藥典》中款冬花薄層鑒別方法為采用硅膠GF254板，以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(6∶1)為展開劑，展開自然晾干后直接置于紫外燈254 nm下檢視。然而實驗發(fā)現(xiàn)款冬酮在254 nm波長下未見有明顯的暗斑，對照品和樣品在該條件下均不具有較好的辨識度。后經(jīng)摸索發(fā)現(xiàn)采用硅膠G板展開后用硫酸乙醇顯色劑進行加熱顯色后再置于紫外燈365 nm下檢視，款冬酮呈現(xiàn)清晰的藍色熒光條帶。因歐洲草藥委員會專家提出各國生產(chǎn)石油醚沸程存在較大差異，建議用其他溶劑作為展開劑，經(jīng)調(diào)整最終確定環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)作為展開劑。

3.2 含量測定條件篩選與優(yōu)化

本研究對款冬酮的含量測定提取方法進行了摸索與優(yōu)化，比較了不同提取方法(超聲、回流和冷浸)、提取溶劑量(10、20、30 mL)和提取時間(30、60、90 min)對含量測定結果的影響，最終確定最佳提取條件為20 mL乙醇溶液超聲提取1 h。色譜條件方面比較了不同流動相比例、柱溫、流速和檢測波長對色譜峰的影響，最終確定最佳色譜條件：流動相為甲醇-水(75∶25)，柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL·min-1，檢測波長為220 nm。

綜上所述，本研究建立的薄層鑒別和含量測定方法可靈敏檢測并準確測定款冬花中款冬酮的含量，為《歐洲藥典》款冬花專論提供詳細的研究數(shù)據(jù)。

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ResearchonQualityStandardofFarfaraeFlosforEPMonograph

XIANGTing1，WULizhen1，ZHENGLu1*，ZHOUHaiyan2

[1.YangtzeRiverPharmaceutical(Group)Co.，Ltd.，TheNationalKeyInstituteofTCMQualityControl，StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineoftheP.R.China(NKI-TCM)，JiangsuTaizhou225321，China；2.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorp.，Beijing100195，China]

Objective：To establish the quality standard of Farfarae Flos mainly including TLC method and HPLC determination method，according to the technical guide for the elaboration of EP monographs.Methods：Tussilagone was selected as the marker constituent in the TLC identification method.After developing with cyclohexane-ethyl acetate(4∶1)，the plate was sprayed with alcoholic solution of sulfuric acid Reagent and heated，and then examined under 365 nm UV light.In the HPLC determination method，a YMC-Pack ODS-A chromatographic column was used for the separation，with the mobile phase of methanol-water in a gradient elution procedure.The column temperature was set at 35 ℃，the flow rate was set as 0.8 mL·min-1and the wavelength was set at 220 nm.Results：The TLC identification method was established with good specificity，and the fluorescent zone of tussilagone was clearly detected with high distinguishing degree.Results：of HPLC method validation showedthat the determination method kept good linearity(r=0.999 9)in the concentration range of 3.074-153.7 μg·mL-1for tussilagone.The average recovery was 99.9%(RSD=2.0%)，RSDs of repeatability，intermediate precision，stability and robustness test were no more than 2.0%.Conclusion：In this paper，a sensitive TLC identification method and an accurate HPLC determination method were established for the quality control of Farfarae Flos，which provided useful research data for EP monograph.

Farfarae Flos；European Pharmacopeia；tussilagone；TLC identification；determination.

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201307002)

] 鄭璐，高級工程師，研究方向：中藥歐盟質量標準；E-mail：zhenglu@yangzijiang.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.006

2016-07-01)

*[