化學發光免疫法檢測GADA、ICA、ZnT-8A在T1DM診斷中的應用研究

李彥青 趙鴻斌 孫曉慧

·論著·

化學發光免疫法檢測GADA、ICA、ZnT-8A在T1DM診斷中的應用研究

李彥青 趙鴻斌 孫曉慧

目的對比分析免疫印跡法(IB法)及化學發光免疫法(CLISA法)檢測谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、胰島細胞抗體(ICA)、鋅轉運蛋白8抗體(ZnT-8A)結果，探討這三種抗體聯合檢測對T1DM的臨床意義。方法選取2015年1月至2016年10月內分泌科收治的100例糖尿病患者的臨床資料，其中T1DM 32例， T2DM 68例及100例健康人群(健康對照組)，分別采用IB法及化學發光酶免疫法進行GADA、ICA、ZnT-8A檢測。結果T1DM組CLISA法檢測 GADA、ICA及ZnT-8A，陽性率明顯高于T2DM組和健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；CLISA法檢測 GADA、ICA及ZnT-8A，敏感性均高于IB法，差異有統計學意義(P<0.05)；CLISA法檢測 ICA及ZnT-8A，特異性均高于IB法，差異有統計學意義(P<0.05)。結論化學發光酶免疫法檢測GADA、ICA、ZnT-8A對診斷T1DM有更高的臨床價值。

T1DM;GADA;ICA;ZnT-8A;免疫印跡法;化學發光免疫法

糖尿病(DM)是一組以高血糖為典型特征伴有多種并發癥的慢性代謝紊亂綜合征,多由胰島素分泌缺陷或生理活性受損所致，已成為當前臨床上的主要內分泌代謝疾病，根據發病機制不同，臨床上主要分成1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)。T1DM是DM相關抗體對胰島β細胞進行免疫性破壞，導致胰島素分泌不足引起的疾病；T2DM則屬于非胰島素依賴性DM，較為常見[1,2]。這種分型主要依據患者臨床表現及血胰島素水平。隨著DM免疫標志物研究的進一步發展，DM相關的血清標志物包括GADA、ICA及ZnT-8A，逐步受到研究者的重視，可以為患者提供更合理的臨床救治提供參考價值[3-5]。 T1DM是胰腺β細胞發生細胞介導的自身免疫反應損傷引起的，患者血清中可以檢測到GADA及ICA等胰島相關自身抗體[6]。有研究報道，胰島細胞抗體(ICA)被視為DM的高危指標，其陽性檢測率會隨著患者病程延長而降低，谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)是一種抑制性神經介質氨基丁酸生物合成酶，持續時間長，且陽性率較高[7]，有研究報道，GADA是兩種DM陽性率最高的指標[8,9]。鋅轉運蛋白8抗體(ZnT-8A)是一種胰島β細胞分泌顆粒膜蛋白，通過影響鋅離子濃度而在胰島素合成和分泌中發揮重要作用，2007年被確定為T1DM的新的自身抗體[10]。免疫印跡法(IB法)是免疫組織化學分析技術和高分辨率凝膠電泳結合，待測抗原轉移到膜上，檢測與其發生特異性抗體，目前逐漸成為抗原檢測的常用方法。化學發光法是依據待測物濃度和發光強度進行檢測的發光分子光譜分析法，靈敏度高，檢測時間短，目前在臨床應用廣泛[11,12]。本研究為進一步探討T1DM臨床特點及差異性，選取100例DM患者的臨床資料，其中T1DM 32例， T2DM 68例及100例健康人群(健康對照組)，分別采用免疫印跡法及化學發光酶免疫法對谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、胰島細胞抗體(ICA)、鋅轉運蛋白8抗體(ZnT-8A)進三種抗體進行檢測，然后對比分析檢測結果，比較兩種方法的應用效果，進一步探討這三種抗體聯合檢測對T1DM診斷的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2016年10月石家莊市第一醫院收治的首次診斷DM患者100例，其中T1DM 32例，T2DM 68例及100例健康人群(健康對照組)，均符合1999年WHO制定的DM診斷標準，排除繼發性DM及妊娠性DM。T1DM組患者共32例，其中男15例，女17例;年齡8～23歲，平均年齡(13.1±5.22)歲；T2DM組患者68例，其中男38例，女30例;年齡28～61歲，平均年齡(38.14±7.61)歲；另外選取同時期本院健康體檢者100例，其中男51例，女49例;年齡17～62歲，平均年齡(24.23±10.38)歲；無DM家族史，空腹血糖正常。

1.2 方法

1.2.1 標本采集:分別采集3組患者空腹新鮮血標本4 ml，室溫放置30 min血液凝固后，以3 000 r/min的速度離心10 min后留取血清，-20℃凍存備用。

1.2.2 化學發光免疫法檢測GADA、ICA及ZnT-8A：GADA、ICA及ZnT-8A化學發光免疫試劑盒購自深圳新產業生物有限公司生產的試劑盒，嚴格按照試劑說明書進行操作，儀器選用半自動LUMINO發光儀，血清GADA>30 U/ml即為陽性，血清ICA>100 U/ml即為陽性，血清ZnT-8A>50 U/ml即為陽性。

1.2.3 免疫印跡法檢測GADA、ICA及ZnT-8A：糖尿病自身免疫抗體GADA、ICA及ZnT-8A試劑盒購自深圳亞龍輝生物有限公司生產的試劑盒，嚴格按照試劑說明書進行操作，用標準對照帶圖觀察特定區域條帶，顯色深于弱陽性質控帶顏色為陽性，顯色弱于弱陽性質控帶顏色為陰性。

1.3 統計學分析 應用SPSS 20.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清GADA、ICA及ZnT-8A檢測結果

2.1.1 CLISA法檢測結果： T1DM組GADA陽性率為46.88%(15/32)、ICA陽性率為34.38%(11/32)及ZnT-8A陽性率為40.63%(13/32)；T2DM組GADA陽性率為30.88%(21/68)、ICA陽性率為26.47%(18/68)及ZnT-8A陽性率為11.76%(8/68)；健康對照組GADA陽性率為3.0%(3/100)、ICA陽性率為1.0%(1/100)及ZnT-8A陽性率為2.0%(2/100)。T1DM組和T2DM組GADA、ICA及ZnT-8A陽性率均明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；T1DM組GADA、ICA及ZnT-8A陽性率明顯高于T2DM組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.1.2 IB法檢測結果：T1DM組GADA陽性率為18.75%(6/32)、ICA陽性率為18.75%(6/32)及ZnT-8A陽性率為21.88%(7/32)；T2DM組GADA陽性率為10.29%(7/68)、ICA陽性率為14.71%(10/68)及ZnT-8A陽性率為10.29%(7/68)；健康對照組GADA陽性率為3.0%(3/100)、ICA陽性率為3.0%(3/100)及ZnT-8A陽性率為1.0%(1/100)。結果顯示，T1DM組和T2DM組GADA、ICA及ZnT-8A陽性率均明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；T1DM組GADA、ICA及ZnT-8A陽性率明顯高于T2DM組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.1.3 CLISA法和IB法檢測結果：T1DM組和T2DM組CLISA法檢測GADA、ICA及ZnT-8A陽性率明顯高于IB法，差異有統計學意義(P<0.05)；健康對照組CLISA法檢測GADA、ICA及ZnT-8A陽性率與IB法比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 兩種方法檢測3組受試著血清GADA、ICA及ZnT-8A比較 例

注：與對照組比較，*P<0.05,#P<0.01；與T1DM組比較，△P<0.05

2.2 GADA、ICA及ZnT-8A敏感性和特異性檢測結果 CLISA法檢測 GADA、ICA及ZnT-8A，敏感性均明顯高于IB法(P<0.05)；特異性亦均高于IB法，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩種方法檢測血清GADA、ICA及ZnT-8A敏感性和特異性比較 %

注：與IB法比較，*P<0.05

2.3 GADA、ICA及ZnT-8A聯合檢測結果 GADA、ICA及ZnT-8A三種抗體聯合檢測結果，T1DM組CLISA法陽性率65.63%(21/32)，IB法陽性率34.38%(11/32)；T2DM組CLISA法陽性率42.65%(29/68)，IB法陽性率20.59%(14/68)；健康對照組CLISA法陽性率6.0%(6/100)，IB法陽性率7.0%(7/100)。T1DM組和T2DM組陽性率明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，T1DM組陽性率明顯高于T2DM組(P<0.05)；T1DM組和T2DM組CLISA法檢測陽性率明顯高于IB法，差異有統計學意義(P<0.05)；健康對照組CLISA法檢測陽性率與IB法比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩種方法GADA、ICA及ZnT-8A聯合檢測陽性率比較 例

注：與健康對照組比較，*P<0.01；與T1DM組比較，#P<0.05；與CLISA法比較，△P<0.05

3 討論

中國DM患者近1億，高危人群約1.5億，其發病率呈明顯的上升和年輕化趨勢。其中T1DM患者亦在不斷的增多，其生存現狀亦不容樂觀。如果能有更高臨床價值的檢測方法發現現在的T1DM患者，使其疾病控制在未發或者初發階段，必將大大的改善T1DM患者的生存現狀，提高其生活質量并延長壽命。

近年來發現DM和其他多種自身免疫性疾病一樣，在臨床癥狀出現前數月或數年即可出現自身抗體陽性，其初期表現可能是一種或者少量自身抗原的抗體，之后便發展為針對多種抗原的自身抗體。

DM自身抗體是DM發病過程中胰島自身免疫損傷而產生的，主要包括GADA、IA-2A、ICA、IAA及ZnT-8A，在T1DM患者及T2DM患者中均可檢測出一定陽性率的胰島自身抗體[9]。有報道顯示胰島自身抗體陽性人群中60%～70%經數月或數年隨訪后發生T1DM[9]。

GADA是T1DM患者體內出現最早的抗體，GADA是由于機體感染柯薩奇病毒后，病毒蛋白系列與谷氨酸脫羧酶的氨基酸系列相似而發生的交叉免疫反應而產生，是由分泌谷氨酸脫羧酶生成γ-氨基丁酸的神經細胞和非神經細胞組織合成的，GADA一旦生成可與谷氨酸脫羧酶結合，使之失去活性，干擾胰島素合成與分泌。GADA陽性預示內分泌胰島素的缺乏或缺失，是胰島素功能減退速度的主要預測因子，有預測胰島功能的價值，屬于T1DM的自身抗體[4]。有報道認為GADA是破壞胰島細胞，引起T1DM的關鍵抗原，可能是T1DM自身免疫的始動靶抗原，與其他抗體相比，GADA與胰島β細胞損壞相關性好，在患者體內持續時間長且隨病程延長下降幅度很小，陽性率高[6]，是診斷T1DM和LADA最敏感且應用最廣泛的指標之一。ICA 是針對胰島β細胞胞漿成分的混合抗體。ICA的陽性率與病程長短有關，隨著病程延長逐漸下降，可能與抗原的減少或消失有關。ZnT-8A是2007年新發現的一種與T1DM相關的非常重要的自身抗體[10]。ZnT8蛋白為基因SLC30A8(染色體8q24.11)所編碼，屬于鋅轉運體(ZnT/SLC30)家族成員，僅在胰島β細胞高表達，分布在胰島細胞中含有胰島素顆粒的囊泡膜上，ZnT8能促進細胞質中鋅轉移至有胰島素顆粒的囊泡中儲存起來，當胰島β細胞受到刺激時如高血糖，即通過胞吐作用將其分泌出去；ZnT8通過影響Zn在胰島素顆粒中的聚集從而影響胰島素的穩定、儲存及分泌。因此，ZnT-8A的出現成為了異常體液免疫應答攻擊胰島β細胞的標志。ZnT-8A的發現不僅有助于提高對T1DM的認識，對臨床上預測和診斷T1DM有十分重大的價值。

本研究選取2015年1月至2016年1月我院內分泌科收治的100例糖尿病患者的臨床資料，其中T1DM 32例， T2DM 68例及100例健康人群(健康對照組)，分別采用免疫印跡法及化學發光免疫法對GADA、ICA、ZnT-8A三種抗體進行檢測。通過檢測方法的靈敏度及陽性率進行對比，T1DM組CLISA法檢測 GADA、ICA及ZnT-8A，陽性率明顯高于T2DM組和健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；CLISA法檢測 GADA、ICA及ZnT-8A，敏感性均高于IB法，差異有統計學意義(P<0.05)；CLISA法檢測 ICA及ZnT-8A，特異性性均高于IB法，差異有統計學意義(P<0.05)；GADA、ICA及ZnT-8A三種抗體聯合檢測，T1DM組和T2DM組用CLISA法檢測陽性率明顯高于IB法，差異有統計學意義(P<0.05)。T1DM組分別檢測GADA、ICA及ZnT-8A三種抗體陽性率明顯高于T2DM組和健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；T1DM組三種抗體聯合檢測陽性率亦明顯高于T2DM組和健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。這一結果提示，GADA、ICA及ZnT-8A三種抗體檢測對于T1DM患者的發現具有很好的應用價值，且應用化學發光免疫法聯合檢測三種抗體對T1DM患者具有更高的臨床價值，值得臨床推廣及普及運用。

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2017-04-16)