浮游植物顯微鏡計數方法適用范圍探究

楊萍萍

（大理白族自治州環境監測站云南大理671000）

浮游植物顯微鏡計數方法適用范圍探究

楊萍萍

（大理白族自治州環境監測站云南大理671000）

通過采集洱海浮游植物樣品對各顯微鏡計數方法進行比較，結果表明：全片法適用于浮游植物細胞密度低水體的測定，行格法適用于浮游植物細胞密度適中水體的測定，對角線法適用于浮游植物細胞密度適中或高水體的測定。

浮游植物；數量測定；顯微鏡

引言

浮游植物是指生活在水中營浮游生活的自養型生物，也被稱為浮游藻類，已知淡水藻類有25000種左右，而中國已發現的淡水藻類約9000種[1]，浮游植物是水體生態系統的重要初級生產者，其種類組成和數量分布的生態學特征是水生生態系統的重要研究內容[1、2]。浮游植物對其所處的水生態環境反應靈敏，能夠對水體營養狀態的變化迅速做出響應，其種屬組成及群落結構能夠準確反映水環境現狀，是評價水環境現狀的重要指示生物[1]。

顯微鏡計數法是目前淡水浮游植物測定的基本方法。隨著科技的發展，浮游植物測定還有分光光度法、熒光分光光度法、流式細胞顯微鏡計數法、庫爾特計數法等。[3]但是這幾種方法僅能夠分析測定浮游植物細胞密度，顯微鏡計數法不僅可以測定水體中浮游植物細胞密度，還可以進行浮游植物的種屬及群落結構分析，仍是目前進行浮游植物測定的主流方法。

目前國家尚未出臺浮游植物測定的標準方法，實際應用中顯微鏡技術法還分為全片計數法、行格計數法、對角線計數法。[1、4]各種方法針對不同水體浮游植物存量存在不同的使用范圍。為探究各種方法的優缺點及適用范圍，采集洱海水樣，通過濃縮、稀釋處理調整樣品濃度，分別用三種不同技術方法進行測定，比較分析各種方法利弊及適用范圍。

洱海屬于中營養湖泊，位于高原，浮游植物種屬豐富。根據大理州環境監測站2013-2015對洱海浮游植物36期396組定性、定量標本測定結果，共采集鑒定到浮游植物8門71屬。浮游植物種屬豐富，細胞個體從大到小均有所涵蓋，適宜作為浮游植物測定實驗水樣。

1 材料和方法

1.1 試劑和設備

魯哥氏液，40 g碘溶于含碘化鉀60 g的1 000 m L水溶液中；2.5 L有機玻璃采水器；Nikon 50i顯微鏡；顯微鏡數碼相機；0.1 mL藻類計數框，20×20 mm，框內橫豎各10格；22×22 mm蓋玻片；100μl移液槍。[8]

1.2 水樣的采集與制備

從洱海中采集水樣，經初步測定，水樣初始濃度為107個細胞/升。于相同點位相同時間共采集3個樣品，用有機玻璃采水器采集表層水樣1L，裝入樣品瓶，現場加入15ml魯哥試劑固定。將兩個樣品分別進行稀釋和濃縮，經稀釋10倍調整濃度到106個細胞/升，濃縮10倍調整濃度至108個細胞/升。[8]濃度調整后，作為初始樣品，針對三種濃度水樣，待計數。

1.3 顯微鏡計數

分別用全片計數法、行格計數法、對角線計數法（分別簡稱：全片、行格、對角），對每一濃度樣品計數，每個樣品每種方法計數7次，報出7次計數結果及種屬組成，并對計數時間、溫度、濕度等實驗條件進行記錄。藻細胞分類等級定到屬。[9]計數時，若破損細胞或葉綠體缺失則不計數。若計數過程中由于時間較長，水分蒸發導致裝片產生氣泡，則應重新制片計數。每個水樣平行計數2次，計數結果與其平均值之差控制在±15%以內。

全片計數法：對計數框內100個小格的全部藻體進行計數；行格計數法：計數框每列或每行的10個小格組成一個長條，對計數框內第2、5、8條長條計數。與長條右側或下刻度相交的個體計數，與左側或上刻度相交的個體不計數。對角線計數法：計數框對角線上的十個小方格區域內的所有藻細胞逐一分類計數。破損細胞不計數。[5、6]

2 實驗結果

2.1 數據結果

通過對三組樣品采用不同方法計數，共獲得浮游植物測定數據351組，其中每組包含浮游植物細胞密度及水樣中浮游植物種屬組成、計數時長（表1-3）。其中，108濃度樣品由于水樣中藻類細胞濃度高，藻類種屬較多，根據行格計數法所用時間估算，若物鏡倍數為20倍條件下，全片計數法平均計數時長約為2小時23分鐘。計數時間較長，且裝片在計數至50分鐘左右（雨天溫度13度，濕度68%）蒸發出現氣泡，導致不能完成實驗。若在物鏡倍數為10倍條件下，除轉板藻、新月藻等大型藻體外，大部分藻屬細胞較小，計數較困難。單細胞藻類如小環藻、衣藻、藍隱藻、藍纖維藻、四角藻等在10倍物鏡下較難分辨，故108樣品濃度進行全片計數不可行。

表1 洱海水樣三種藻類計數方法實驗結果單位：個細胞/升

2.2 結果分析

從實驗結果中得知，當水體中浮游植物細胞密度較低時，對角線法和行格法實驗結果相近，相對標準偏差較高，測定出細胞種屬數較全片法少。全片法相對標準偏差較低，結果穩定，所觀察中出現的浮游植物種屬較其他兩種方法多。故全片法適用于浮游植物細胞密度低的水體的測定。

當水體中浮游植物細胞密度適中時，行格法和全片法相對對角線法相對標準偏差較小，結果較穩定，從浮游植物種屬組成、浮游植物細胞密度結果、計數時長等綜合分析，行格法較適用于浮游植物細胞密度適中的水體。

當水體中浮游植物細胞密度較高時，全片法已不能正常使用，此時行格法與對角線法測定出種屬組成相近。行格法相對標準偏差較低，結果較穩定，但細胞密度測定結果較低，技術時間長。對角線法細胞密度測定結果與多種方法測定結果均值相近，計數時長適中，相對標準偏差在15%以內。故對角線法較適宜浮游植物細胞密度較高的水體。

2.3 各種計數方法比較

各種浮游植物顯微鏡技術方法優缺點比較。

表2 浮游植物顯微鏡計數方法對比分析

結語

浮游植物種類及群落結構分析對深入研究淡水浮游植物生理特征、群落結構及功能、在淡水生態系統中的作用都具有重要的科學意義。[1]顯微鏡計數法中對角線法、行格法、全片法在不同實驗條件下具有各自的優缺點。

全片法測定結果穩定，測定出種屬全；但工作量最大，不適用于高濃度浮游藻類樣品。行格法實驗測定耗時相對全片法短，測定樣品速率適中；但在低濃度時測定結果不穩定，測定出種屬少，對于高密度浮游植物水樣，計數耗時較長，由于水分蒸發計數框內會產生氣泡，影響計數結果的準確性。對角線法實驗測定耗時短，測定樣品速率高，對角線選取樣品分布具有代表性；但在低濃度時測定結果不穩定，測定出種屬少。全片法適用于浮游植物細胞密度低時的測定，行格法適用于浮游植物細胞密度適中情況下的測定，對角線法適用于水體中浮游植物細胞密度適中或較高時的測定。選擇適當的浮游植物計數方法對浮游植物的研究十分重要，可以根據樣本大小、便于分析、樣品處理率等不同的需求選擇最佳計數方法。

[1]錢奎梅，劉霞，陳宇煒，淡水浮游植物計數與定量方法湖泊科學2015，27（5）：767-775.

[2]李志勇，劉津，高東微等.瓶裝飲用水中浮游藻類計數方法研究[J].食品科技.2009.34（7）:266-270.

[3]金玉，張瑜霞，李愛軍等對角線法分析高密度浮游藻類數量的研究環境科學與技術，2013（36）

[4]張瑜霞，金玉，施擇等富營養化水體藻類顯微鏡計數方法改進研究福建分析測試，2014，23（1）

[5]趙孟緒水庫藻類監測原理與方法分析[J].廣東水利水電.2010.8:61-63.

[6]劉曉江，施心路，齊桂蘭等.淡水藻類在監測水質和凈化污水中的應用[J].生物學雜志，2010，27（6）:76-78，86.

[7]張秋勁，何冬瓊，于飛等.四川省重點流域浮游植物群落調查研究[J].中國環境監測，2012，28（5）:53-56.

[8]國家環境保護總局，水和廢水分析方法編委會水和廢水監測分析方法[M].北京：中國環境科學出版社.2002.

[9]胡鴻鈞，魏印心.中國淡水藻類：系統、分類及生態[M].北京:科學出版社，2006.