春柴胡HPLC法指紋圖譜的研究

鄭 正 汪海宣 苗仁華 蔣 菲

（合肥市食品藥品檢驗中心，安徽 合肥 230001）

春柴胡HPLC法指紋圖譜的研究

鄭 正 汪海宣 苗仁華 蔣 菲

（合肥市食品藥品檢驗中心，安徽 合肥 230001）

目的建立春柴胡的HPLC法指紋圖譜，為科學評價與有效控制春柴胡的質量提供快捷、有效的方法。方法采用HPLC法測定10批不同產地春柴胡樣品。色譜條件：MERK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），流速1.0 mL/min，檢測波長256 nm，柱溫為35 ℃。結果本研究建立的分析方法有良好的重復性，操作簡便、快速，結果客觀、準確。結論能較全面的反映出春柴胡中所含成分的種類和數量，能更好的表明其的內在質量，可作為其產品質量控制的有效手段。

春柴胡；指紋圖譜；HPLC

春柴胡為傘形科（Umbelliferae）植物狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd．的干燥帶根全草。主產于江蘇大部分地區和安徽東部一帶，由于春季采收，故習稱“春柴胡”。為我國傳統中藥，苦、微寒，具有和解表里，退熱疏肝、升舉陽氣等功效[1-3]。其主要化學活性成分為皂苷類、黃酮類、揮發油類等成分。目前，春柴胡的質量控制標準較少，僅有《江蘇省中藥材標準1989年版》和《安徽省中藥飲片炮制規范2005年版》分別對春柴胡藥材及飲片質量標準進行控制，且只有外觀形狀等項目，較難客觀的控制其質量。中藥材中含有多種化學組分，其多數成分含量相對于主要活性成分較低，且藥理作用不是非常明確。為了開發利用其資源，完善其質量標準，更好的對春柴胡的質量進行控制，采用中藥指紋圖譜的方法來對市場上不同產地的春柴胡進行研究；建立HPLC法指紋圖譜測定條件并進行一系列方法學考察，對春柴胡中各主要成分的指紋圖譜進行綜合評價，建立春柴胡在一定處理和分析條件下的對照指紋圖譜，為春柴胡的質量控制研究開辟一個新思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Thermofisher U3000高效液相色譜儀，DAD檢測器；IKA研磨粉碎機，Fisher超聲波清洗器；電子天平（METTLER，XP205）。所有計量儀器和量具均經檢定和校正。

1.2 試劑與試藥：蕓香苷對照品（中國食品藥品檢定研究院；批號：100080-201408；含量：92.8%）；乙腈為色譜純，重蒸水。10批藥材來源見表1。

以上藥材經合肥市食品藥品檢驗中心劉業飛主任中藥師鑒定均為正品。

1.3 指紋圖譜相似度計算軟件：國家藥典委員會開發的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（版本號2012.130723）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件：參照相關文獻[4]，摸索春柴胡色譜條件，確定測定色譜柱為Thermo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）；流速：1.000 mL/min，柱溫：35℃，進樣量：5 μL。測定波長：經研究發現，在波長為256 nm下，春柴胡藥材中的蕓香苷和其他一些化學組分均能較好的響應，蕓香苷成分是此條件下響應最大的物質，且各峰分離度和峰形均良好，理論板數高，因此確定256 nm為春柴胡藥材指紋圖譜的檢測波長，見圖1、圖2。

表1 春柴胡產地

圖3 10批春柴胡批疊加HPLC色譜圖

圖4 春柴胡藥材對照指紋圖譜

圖5 10批春柴胡藥材指紋圖譜

圖1 春柴胡藥材樣品色譜圖

圖2 蕓香苷參照物色譜圖

根據與標準物質對照，可指認春柴胡藥材指紋圖譜中的主要色譜峰；其中色譜圖中保留時間約為17 min峰為蕓香苷，其他峰為在該指紋圖譜測定條件下所測得的能夠明確反映春柴胡藥材的主要成分。

2.2 參照物溶液的制備：研究發現，春柴胡藥材中含有蕓香苷，具有較高的含量且成分比較穩定，蕓香苷在該色譜系統條件下響應較高，所以選擇蕓香苷作為參照物。精密稱取蕓香苷對照品制成0.25 mg/mL的參照物溶液。見圖3。

2.3 供試品溶液的制備：參照中國藥典2015年版一部柴胡藥材標準[1]，確定春柴胡的主要成分提取方法為：取春柴胡藥材，研磨粉碎，過40目篩，取粉末約0.25 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇70 mL，浸泡2 h，超聲處理30 min，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 精密度試驗：取春柴胡藥材（產地：句容），照2.3項下方法制備樣品，依法測定記錄色譜圖，用第一次進樣所得色譜圖中蕓香苷峰等5個成分峰作為校正峰，計算6份色譜圖的相似度，其結果均不小于0.987，均達到中藥色譜指紋圖譜的相似度評價標準（≥0.950），結果本方法精密度良好。

2.5 重復性試驗：取春柴胡藥材（產地：句容），照2.3項下方法制備樣品6份，依次測定記錄色譜圖，用第一份樣品的色譜圖中蕓香苷峰等5個成分峰作為校正峰，計算5份樣品色譜圖的相似度，結果均不小于0.999，均達到中藥色譜指紋圖譜的相似度評價標準（≥0.950），結果本方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗：取春柴胡藥材（產地：句容），照2.3項下方法制備樣品，放置0、2、4、8、12、24 h后進樣，記錄色譜圖，用0 h進樣的色譜圖中蕓香苷峰等5個成分峰作為校正峰，用軟件計算6份色譜圖的相似度，結果均不小于0.994，均達到中藥色譜指紋圖譜的相似度評價標準（≥0.950），表明該方法制備所得樣品溶液在12 h內穩定。

2.7 春柴胡藥材主要成分對照指紋圖譜生成：按2.3項下方法制備樣品溶液，對10批不同產地春柴胡藥材的測定，記錄色譜圖，生成疊加液相色圖譜（圖4），以產地為句容樣品色圖譜作為參照圖譜模板，導出cdf色譜文件，時間窗設置為0.1，以蕓香苷峰等5個成分峰作為校正峰，用導入指紋圖譜相似度計算軟件，以這10批樣品色譜圖為基礎生成一個對照指紋圖譜，此圖譜即為對照指紋圖譜。

2.8 10批不同產地的春柴胡藥材指紋圖譜相似度計算：計算相似度，獲得結果顯示各指紋圖譜的相似度均＞0.994。見圖5。

3 結果與討論

3.1 目前，中藥材及飲片的鑒別、分類和質量評定的采用的方法一般是經驗鑒別、顯微鑒別等表觀分析，缺乏從統計分析數據中獲得統一的評價依據。中藥色譜指紋圖譜相似度軟件計算方法使得數據處理過程方便、快速，能較全面的反映出春柴胡中所含成分的類別和含量，能更好的表明其的內在質量可作為其產品質量控制的有效依據。

3.2 本方法簡單操作方便，實驗表明，各地產的春柴胡真品質量差異較小，在指紋圖譜中反映相似度比較高，但我們僅僅初步研究了甲醇提取物的指紋圖譜，不能系統的反應藥品質量，只能對春柴胡的初步質量控制。

3.3 研究中發現春柴胡和柴胡的指紋圖譜相似程度差異較大，所以入藥時春柴胡是不是能和柴胡混用還待進一步研究探討。

[1] 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典2015年版一部[M].北京:化學化工出版社,2015:158-159.

[2] 中國醫學科學院.中藥志[M].北京:人民衛生出版社,1959:366-374.

[3] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第27卷)[M].北京:科學出版社,1979:51.

[4] 韋英杰,王茉,寧青,等.HPLC法同時測定柴胡與春柴胡中皂苷類及黃酮類成分的含量[J].藥物分析雜志,2011,31(5):879-883.

R282.710.3 文獻標識碼：B 文章編號：1671-8194（2017）23-0027-02