實驗性NOD小鼠慢性淋巴細胞性甲狀腺炎造模建立及其機制研究

葉志鵬 吳可人 方蓉 李寧 徐濤 金法

實驗性NOD小鼠慢性淋巴細胞性甲狀腺炎造模建立及其機制研究

葉志鵬 吳可人 方蓉 李寧 徐濤 金法

目的 探討NOD小鼠慢性淋巴細胞性甲狀腺炎（CLT）建模方法及其機制研究。方法 NOD小鼠20只，隨機分為2組，對照組予每天飲用蒸餾水，而造模組飲用0.05%碘水（0.64g NaI/L），持續8周后取甲狀腺組織及血漿，觀察兩組小鼠甲狀腺體組織病理改變和血漿抗小鼠TG抗體水平變化；ELISA測定小鼠脾臟中IL-4或IFN-γ，分析碘劑對CLT小鼠Th1/Th2細胞比值的影響。結果 （1）與對照組比較，造模組炎性細胞浸潤程度較大，且差異有統計學意義（P＜0.05）。（2）血漿中血漿抗小鼠 TG抗體OD值，造模阻比對照組有明顯升高（P＜0.05）。（3）與對照組比較，造模組中IL-4明顯下降（P＜0.05），IFN-γ明顯升高（P＜0.01），IFN-γ/IL-4比值升高（P＜0.05）。結論 碘劑誘導小鼠慢性淋巴細胞性甲狀腺炎造模建立是可行的。過量碘劑能通過促進IFN -γ等Th1細胞因子分泌，抑制IL -4等Th2細胞因子分泌，使Th1 /Th2 細胞平衡向 Th1 方向偏離，形成免疫性甲狀腺炎。

橋本甲狀腺炎 碘劑 造模 Th細胞

慢性淋巴細胞性甲狀腺炎（CLT）以甲狀腺內單核細胞浸潤、甲狀腺球蛋白（TG）和甲狀腺多氧化物酶抗體的生成為主要特征，受遺傳和環境等多種因素影響［1-2］，其確切發病機制尚不明確。碘作為自身免疫性甲狀腺疾病（AITD）發病的重要環境因子，其作用環節和機制尚未明確，動物試驗表明當增加碘的攝入時，動物甲狀腺內淋巴及單核細胞浸潤程度也逐漸加重［3］。2014年8月至2017年8月作者采用碘攝入建立實驗性小鼠慢性淋巴細胞性甲狀腺炎模型，同時為高碘食物致小鼠橋本甲狀腺炎的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 6～8周齡NOD小鼠20只（購于北京康生物有限公司），體質量18～22g，雌雄不限。小鼠稱其體重，按隨機數字表法分為2組，分別為對照組和造模組，每組各10只（造模組在實驗過程中死亡1只，實際數目為9只）。

1.2治療方法:對照組患者給予吸氧、保持呼吸道通暢,抗感染,平喘,祛痰,適當強心,利尿,糾正水、鹽、電解質及酸堿平衡紊亂等綜合治療。觀察組在對照組基礎上,另外給予低分子肝素鈣4000U皮下注射,2次/d,再給予前列地爾10μg靜脈注射,1次/d,總療程10d。

1.2 試劑與儀器 低速離心機購于美國Beckman公司；Olympus顯微鏡（BX51+FL，Olympus，Japan）包埋機（Leica EG1150H）；LKBV型超薄切片機（瑞典LKB公司）；ELX800TM 酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；小鼠抗甲狀腺球蛋白抗體（ATGA/TGAB）酶聯免疫吸附測定試劑盒購于上海西唐公司；小鼠白介素-4（IL-4）及小鼠γ干擾素（IFN-γ）酶聯免疫檢測試劑盒購于上海西唐公司。

1.3 方法 （1）動物模型建立：兩組NOD小鼠相同的食料飼養，環境溫度為18～22℃，相對濕度為50%～60%。對照組予每天飲用蒸餾水，而造模組飲用0.05%碘水（0.64gNaI/L），持續8周［4］。（2）標本采集：8周后小鼠乙醚麻醉，眶靜脈取血，室溫靜置6h，3000r/min離心20min，分離血清并冷藏標本。頸部正中切口，分離皮膚及肌肉層，暴露器官，顯露甲狀腺軟骨側后方的兩葉甲狀腺。將氣管和甲狀腺一并取下，迅速剝離甲狀腺，冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，并放置4%甲醛溶液中固定。同時，腹部正中切口，分離皮膚及肌肉，暴露脾臟，離斷脾血管及韌帶，冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，并1～4℃溫度下冷藏標本。（3）甲狀腺病理學觀察：小鼠甲狀腺組織4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成4μm切片，蘇木素-伊紅（HE）染色。按單核細胞浸潤程度分級：0級：正常甲狀腺組織；Ⅰ級：＜1%的甲狀腺有淋巴細胞浸潤；Ⅱ級：1%～10%淋巴細胞浸潤；Ⅲ級：10%～40%淋巴細胞浸潤；Ⅳ級：＞40%淋巴細胞浸潤。（4）IFN-γ和IL-4細胞因子測定：在各孔加入標準品或樣品各100μl，37℃孵育90min；加入100μl生物化抗體工作液，37℃孵育60min；洗滌3次；加入100μl酶結合物工作液，37℃孵育30min；洗滌5次；加入90 μl底物溶液，37℃孵育15min左右；加入50μl終止液，立即在450nm波長測量OD值并計算結果。（5）血漿抗小鼠TG抗體水平測定：采用小鼠抗甲狀腺球蛋白抗體（ATGA/TGAB）酶聯免疫吸附測定試劑盒雙抗體夾心法測定：在各孔加入標準品或樣品各100μl，37℃孵育90min；加入100μl生物化抗體工作液，37℃孵育60min；洗滌3次；加入100μl酶結合物工作液，37℃孵育30min；洗滌5次；加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右；加入50μl終止液，立即在450nm波長測量OD值并計算結果。

2.3 TgAb各組間比較 8周后，血漿抗小鼠TG抗體OD值，造模組比對照組明顯升高（P＜0.001）。

2 結果

2.1 甲狀腺病理分級比較 顯微鏡下可見對照組甲狀腺濾泡大小不一，較為均勻一致，濾泡上皮細胞為單層立方形或高柱形。造模組濾泡結構紊亂，上皮細胞擠壓變扁，間質減少，炎性細胞浸潤明顯，見圖1、2。根據甲狀腺炎的診斷標準：甲狀腺腺體中炎性細胞的浸潤程度＞2%。根據炎性浸潤程度進行病理分級，造模組與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

本項目污水處理廠服務區域面積為23.4平方公里，工程規劃設計規模為10萬m3/d，其中一期已建規模4.8萬m3/d，尾水排放標準按照 《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）二級標準執行。工程占地面積120.6畝，于2007年開始動工建設，目前該廠正式投入運行。

2.2 IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4各指標組間比較 與對照組比較，造模組中IL-4明顯下降（P＜0.05），IFN-γ明顯升高（P＜0.01），IFN-γ/IL-4比值升高（P＜0.05）。見表2。

表1 甲狀腺病理分級比較

圖1 對照組甲狀腺病理檢查鏡下顯示

圖2 造模組甲狀腺病理檢查鏡下顯示

槭樹科(Aceraceae)植物泛稱“槭樹”或“楓樹”。槭樹科植物樹葉可呈現出綠色、紫色、紅色、金黃色的亮麗色彩且季相變化明顯，是世界著名的色葉觀賞樹種。河南槭樹科植物資源豐富，且具有南北交融、東西過渡的特征[1]。筆者以鄭州地區適宜生長槭樹科植物為例，探討其在植物景觀中的配置模式，以充分挖掘利用河南地區槭樹科植物資源，進而為槭樹科植物在園林景觀中應用提供參考依據。

表2 IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4各指標的組間比較（x±s）

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。正態分布計量資料用（x±s）表示，用配對t檢驗，偏態分布計量資料以中位數表示，用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表3 TgAb各組間比較（x±s）

3 討論

橋本甲狀腺炎（HT）以甲狀腺內單核細胞浸潤、甲狀腺球蛋白（TG）和甲狀腺多氧化物酶抗體的生成為主要特征，受遺傳和環境等多種因素影響［5］，其確切發病機制尚不明確。碘通常以無機碘的形成在胃腸中被吸收，同時其作為T3、T4合成必需成分。然而，碘也是引起甲狀腺疾病的重要環境因素［6］。本實驗通過碘劑造模，造模組甲狀腺病理切片光鏡下顯示濾泡結構紊亂，上皮細胞擠壓變扁，間質減少，炎性細胞浸潤明顯，這些均為HT的主要特征表現，且較對照組明顯增多（P＜0.001），TGAb滴度值較對照組上升明顯（P＜0.001），表明過量碘劑NOD小鼠橋本甲狀腺炎造模的可行性。

Th1和Th2細胞所誘導的免疫反應能交互調節，一旦這種平衡被打破，則出現以 Th1或Th2型優勢反應，引起異常免疫應答，造成病理狀態，將導致疾病發生［7］。在本資料中，與對照組比較，造模組IL-4下降，IFN-γ升高，IFN-γ/IL-4值升高，且均有統計學意義（P＜0.01）。用Th1細胞因子IFN-γ和Th2 細胞因子IL-4反映Th1/Th2細胞免疫應答強度的指標，則造模組較對照組Th1 /Th2 細胞平衡向Th1方向偏離。與較多學者［8］認為HT是Th1型優勢的免疫反應的觀點一致，也證明碘劑NOD小鼠橋本甲狀腺炎造模成功。

綜上，過量碘劑對于NOD小鼠橋本甲狀腺炎造模是可行的。過量碘劑能通過促進IFN -γ等Th1細胞因子分泌，抑制IL -4等Th2細胞因子分泌，使Th1 /Th2 細胞平衡向 Th1 方向偏離，形成免疫性甲狀腺炎。

［1］ Jacobson EM,Huber A,Tomer Y．The HLA gene complex in thyroid autoimmunity:from epidemiology to etiology．J Autoimmun, 2008, 30(1/2):58-62．

［2］ LiM,Boyages SC．Iodide induced lymphocytic thyroiditis in the BB/W rat:evidence of direct toxic effects of iodide on thyroid subcellular structure． Autoimmunity,1994,18(1):31-40．

［3］ Shoenfeld Y,Zandman -Goddard G,Stojanovich L,et al．The mosaic of autoimmunity:hormonal and environmental factors invdved in autoimmune diseases-2008．Isr Med Assoc J,2008,10(1):8-12．

［4］ Pramyothin P,Leung AM,Pearce EN,et．al． Clinical problemsolving． A hidden solution．N Engl J Med,2011,365:(22):2123-2127．

［5］ 陳雪梅,劉燚, 范源,等．碘過量與橋本氏甲狀腺炎的關系研究進展．昆明醫科大學學報,2014,35(12):169-174．

［6］ Weetman AP．Cellular immune responses in autoimmune thyroid diseases．Clin Endocrinol(oxf),2004,61(4):405-413．

［7］ Phenekos C, Vryonidou A, Gritzapis AD, et al． Th1 and Th2 serum cytokine profiles characterize patients with Hashimoto's thyroiditis (Th1)and Graves disease (Th2)． Neuroimmunomodulation, 2004, 11(4):209-213．

［8］ 于秀杰,李慶欣,劉鳳華,等．碘過量和甲狀腺腺球蛋白免疫誘發NOD小鼠甲狀腺炎的病變特征．中華內分泌代謝雜志,2009,25(3),269-273．

Objective To investigate mechanism research and modeling method of Hashimoto’s Thyroiditis of experimental NOD mice. Method 20 NOD mice were divided equally into model group and normal group，and were separately fed with diet of iodine（0.64g NaI/L）and distilled water.Eight weeks later，thyroid tissue and plasma were collected to observe the histopathological changes of thyroid gland and the level of anti TG antibody in plasma. IFN-γ and interleukin-4（IL-4）produced by splenocytes were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Result （1）Compared with control group by histopathology detection，NOD mice developed CLT in normal group was less than that of the model group，which was obviously different（P＜0.05）. （2）There was a difference in serum mTgAb among the both groups，and had statistical significance.（P＜0.05）.（3）In the model groups，the IL-4 was lower，IFN-γ and IFN-γ/IL-4 were higher than that of the normal group. Conclusion It is feasible to establish a model of chronic lymphocytic thyroiditis induced by iodine in mice. Adequate iodine can promote the secretion of Th1 cytokine including IFN-γ and suppress Th2 cytokine including IL-4，which results in the disorder of Th1/Th2，and even Th1 cells take a more important role.

Hashimoto’s Thyroiditis Iodine Modeling Th cell

浙江省中醫藥科技計劃項目（2A11414）

310006 浙江中醫藥大學附屬第一醫院