RP-HPLC法同時測定不同產地墨旱蓮中6個主要成分的含量

馬利，易駿，吳建國，黃運喜，吳巖斌，吳錦忠

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；2.福建教育學院理科部，福建福州350025）

RP-HPLC法同時測定不同產地墨旱蓮中6個主要成分的含量

馬利1，易駿2，吳建國1，黃運喜1，吳巖斌1，吳錦忠1

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；2.福建教育學院理科部，福建福州350025）

目的建立同時測定不同產地墨旱蓮藥材中木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內酯和芹菜素6種化學成分的HPLC方法。方法采用YMC－Pack ODS－A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL／min，檢測波長340 nm，柱溫為25℃。結果在上述色譜條件下，木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內酯和芹菜素獲良好分離，分別在5.5～21.1、6.3～50.3、17.9～71.4、3.8～37.8、4.9～39.4、0.7～5.3 μg／mL內線性關系良好，平均回收率分別為102.92%、98.44%、98.85%、100.91%、98.76%、101.94%。結論該方法穩定可靠、簡便可行，可用于墨旱蓮多種成分的同時定量分析。

HPLC；墨旱蓮；產地；含量測定

墨旱蓮是菊科鱧腸屬植物鱧腸（Eclipta prostrata L.）的干燥地上部分，具有滋補肝腎、涼血止血的功效［1］，墨旱蓮的化學成分主要有黃酮類、噻吩類、三萜皂苷類及香豆草醚類等成分［2］。目前2015年版《中國藥典》對墨旱蓮藥材的質量控制指標仍僅限于蟛蜞菊內酯單一化學成分的含量測定［1］，很難全面反映墨旱蓮藥材整體的質量。旱蓮中的黃酮類成分具有抗骨質疏松、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學活性［3-5］，如木犀草素、木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素和蒙花苷是墨旱蓮抗骨質疏松的主要生物活性成分之一［6］。因此，本實驗建立了同時測定墨旱蓮中5種黃酮類成分和蟛蜞菊內酯的HPLC含量測定方法，為全面控制墨旱蓮藥材的質量提供更加可靠的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器LC-20AT系列高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV檢測器（日本島津公司）；MS105DU電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DFT-200手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 試藥10批墨旱蓮樣品采自福建、廣東、廣西、浙江、江蘇5個省份，經福建中醫藥大學中西醫結合研究院吳錦忠教授鑒定為墨旱蓮（Eclipta prostrata L.）。不同產地墨旱蓮編號、采集樣品地點和日期見表1。木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內酯和芹菜素為本實驗室從墨旱蓮中分離獲得，純度大于98%；乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；甲醇為分析純（上海化學試劑總公司）；乙醇為分析純（上海化學試劑總公司）；超純水為Milli-Q超純水機制備（法國Millipore公司）。

表1 墨旱蓮藥材來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件YMC－Pack ODS－A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相組成為乙腈（A）-0.2%甲酸水（B），梯度洗脫：程序見表2；流速：1.0 mL／min；檢測波長：340 nm；柱溫：25℃；進樣量：20 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.2 混合對照品溶液的制備分別稱取木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素和蟛蜞菊內酯對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成對照品儲備液，備用。

2.3 供試樣品溶液的制備取70℃干燥恒重的墨旱蓮藥材粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%乙醇50 mL，回流提取2 h，過濾，濾液50℃減壓濃縮，用80%甲醇定容至25 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。混合對照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品及供試品HPLC色譜圖

2.4 標準曲線及線性范圍分別精密移取上述混合對照品溶液，加80%甲醇稀釋，稀釋成不同倍數，得一系列對照品混合溶液，搖勻。在上述色譜條件下進樣分析，以各成分峰面積為縱坐標（y），質量濃度（μg／mL）為橫坐標（x），繪制標準曲線，計算回歸方程和線性范圍，見表3。

表3 6個對照品的標準曲線

2.5 精密度實驗精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，計算結果顯示木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內酯和芹菜素峰面積的RSD值分別為0.089%、0.144%、0.077%、0.492%、0.132%、0.56%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性實驗取同一批墨旱蓮樣品，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、12、24 h進行測定，結果顯示木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內酯和芹菜素的結果分別為0.691%、0.273%、0.373%、0.279%、0.179%和0.290%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性實驗取同一批墨旱蓮樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，記錄峰面積。計算結果顯示木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內酯和芹菜素的RSD值分別為2.65%、1.70%、1.52%、2.96%、0.97%和2.17%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗取已知含有量的樣品（編號8），精密稱取6份，分別精密加入一定量對照品，按“2.3”項下方法，制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率。回收率結果顯示：木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內酯和芹菜素的平均回收率分別為102.92%、98.44%、98.85%、100.91%、98.76%、101.94%，RSD分別為2.54%、1.93%、2.47%、1.49%、2.38%、1.06%、2.84%、2.29%，表明6個化合物的加樣回收率良好。

2.9 樣品含量的測定取不同產地的墨旱蓮藥材各1 g，以“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，按“2.1”項色譜條件下分析測定，每批樣品測定3份，以平均值為測定結果，見表4。

表4 樣品含量測定結果（n＝3）mg／g

3 討論

采用本文建立的分析方法對10批不同產地墨旱蓮藥材進行了含量測定，結果表明：不同產地墨旱蓮中6個主要成分的含量具有顯著性差異，木犀草苷含量為0.177～2.346 mg／g，芹菜苷含量為0.168～1.125 mg／g，蒙花苷含量為0.924～9.880 mg／g，木犀草素含量為0.064～0.266 mg／g，蟛蜞菊內酯含量為0.792～10.542 mg／g，芹菜素含量為0.012～0.144 mg／g。蟛蜞菊內酯為香豆草醚類化合物，是墨旱蓮最具特征的化學成分，為墨旱蓮藥材質量控制的指標性成分，2015年版《中國藥典》［1］規定墨旱蓮中蟛蜞菊內酯含量不得少于0.040%為測定標準。從表4中可以看出，所測樣品中蟛蜞菊內酯的含量均符合藥典規定，其中江蘇宿遷所產墨旱蓮中的蟛蜞菊內酯的量最高，廣東揭陽所產墨旱蓮中的蟛蜞菊內酯的量最低。墨旱蓮中黃酮類化合物是其抗骨質疏松活性成分之一［6］，基于墨旱蓮5種黃酮類成分含量差異，單純以蟛蜞菊內酯的含有量來評價墨旱蓮的質量是不夠完整的，建議進行多指標成分的定量測定來控制墨旱蓮及其制劑的內在質量。本研究為中國藥典進行多指標成分控制墨旱蓮質量提供了科學依據。

［1］國家典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：374-375.

［2］夏愛軍，李玲，董昕，等.UHPLC-Q-TOF／MS技術應用于中藥旱蓮草化學成分研究［J］.解放軍藥學學報，2012，28（5）：404-407.

［3］黃運喜，易駿，吳建國，等.鱧腸不同部位抗骨質疏松活性及化學成分比較研究［J］.天然產物研究與開發，2014，26（8）：1229-1232，1298.

［4］王雪梅，張建勝，戴云，等.旱蓮草總黃酮的提取及其體外抗氧化活性研究［J］.時珍國醫國藥，2009，20（2）：356-358.

［5］LIU Q M，ZHAO H Y，ZHONG X K，et al.Eclipta prostrata L. phytochemicals：isolation，structure elucidation，and their antitumor activity［J］.Food Chem Toxicol，2012，50（11）：4016-4022.

［6］林雄浩，吳錦忠.中藥復方二至丸的化學成分及抗骨質疏松研究進展［J］.解放軍藥學學報.2009，25（5）：421-424.

R284.2

A

1000-338X（2017）04-0060-03

2017-04-18

福建省科技廳引導性項目（2015Y0070、2014Y0049）

馬利（1991—），女，2015級生藥學專業碩士研究生，主要從事中藥活性成分及品質評價研究。

吳巖斌（1982—），男，助理研究員。E-mail：wxsq1@163. com