響應面法優選骨碎補總黃酮的超聲提取工藝

李景，林立

（福建醫科大學孟超肝膽醫院，福建福州350025）

響應面法優選骨碎補總黃酮的超聲提取工藝

李景，林立

（福建醫科大學孟超肝膽醫院，福建福州350025）

目的優選骨碎補總黃酮的超聲提取工藝。方法以總黃酮提取率為指標，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken中心組合設計，運用響應面法對影響總黃酮提取率的超聲時間、提取溫度、乙醇體積分數和料液比進行優化。結果最佳工藝為超聲時間30 min、提取溫度66℃、乙醇體積分數64%、料液比1∶92 g／mL。在此工藝條件下，骨碎補總黃酮提取率為4.86%，與理論值4.90%較為相近。結論優選的骨碎補總黃酮超聲提取工藝穩定可行，為骨碎補總黃酮的開發利用提供實驗依據。

骨碎補；總黃酮；超聲提取工藝；響應面法

骨碎補是水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.Sm.的干燥根莖，其性味苦、溫，歸肝、腎經，具有療傷止痛、補腎強骨功效，臨床主要用于跌撲閃挫，筋骨折傷，腎虛腰痛，筋骨痿軟，耳鳴耳聾，牙齒松動等癥。其主要活性成分是以柚皮苷為主的總黃酮，用于治療骨質疏松癥，能明顯抑制骨質疏松癥導致的骨密度下降，在抑制破骨細胞活性的同時，促進成骨細胞增殖［1-2］。目前骨碎補總黃酮多采用正交設計試驗提取［3-6］，關于響應面法優選骨碎補總黃酮超聲提取工藝尚未見報道。響應面分析法能找出各因素的最佳組合和響應最優值，最終找出最優工藝參數，有效地解決多變量問題，在中藥學研究領域已得到很好的應用［7-8］。本實驗以總黃酮提取率為指標，采用響應面法優選骨碎補總黃酮的提取工藝，為該有效成分開發利用提供理論基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器UV-9600紫外可見分光光度計（北京北分瑞利分析儀器有限責任公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；DF-15連續投料粉碎機（大德中藥機械有限公司）。

1.2 試藥骨碎補飲片購自福州九州通大藥房，經福建醫科大學孟超肝膽醫院藥學部劉志芳副主任中藥師鑒定為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.Sm.的干燥根莖；柚皮苷（上海源葉生物科技有限公司，批號：20120221）；甲醇、乙醇均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 標準曲線的繪制參照文獻［9］，取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇配成質量濃度分別為378 μg／mL的對照品溶液，即得。精密吸取柚皮苷對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，以甲醇為空白，于283 nm處測定吸光度（Y），以吸光度（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標，得回歸方程：

Y＝0.039X＋0.011r＝0.999 5，

柚皮苷在6.05～24.19 μg／mL內線性關系良好。

2.2 骨碎補總黃酮的提取及含量測定取骨碎補粗粉約0.25 g，精密稱定，置錐形瓶中；加入規定量不同體積分數乙醇溶液，在規定溫度下超聲提取規定時間，離心，精密吸取提取液2.5 mL于蒸發皿中，水浴蒸干；殘渣用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。按2.1項下方法進行測定，計算總黃酮得率。

2.3 單因素試驗考察分別考察超聲時間、提取溫度、乙醇體積分數、料液比等因素對總黃酮提取率的影響，結果顯示：超聲提取時間30 min、提取溫度約65℃、乙醇體積分數為60%、料液比1∶90時，總黃酮提取率較大，見圖1。

2.4 響應面優化實驗在單因素實驗結果的基礎上，根據Box-Behnken實驗設計原理，選取超聲時間（A）、提取溫度（B）、乙醇體積分數（C）和料液比（D）為考察因素，以骨碎補總黃酮得率為響應值，建立四因素三水平共29個實驗，因素水平及編碼見表1，實驗設計結果見表2。

2.5 建立模型方程與顯著性檢驗在綜合單因素實驗結果的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，選取超聲時間（A）、提取溫度（B）、乙醇體積分數（C）和料液比（D）為考察因素，以骨碎補總黃酮得率為響應值，應用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得到A、B、C、D與骨碎補總黃酮提取率（T）的二次多項回歸方程：

對擬合方程進行方差分析，結果見表3。由表3分析可知：方程模型F值為39.89，P＜0.000 1，具有非常顯著性；失擬項F值為3.65，P＝0.111 7＞0.05，失擬度不顯著；R2＝0.975 5，說明方程擬合度好，試驗誤差小，可以用該模型對試驗結果進行分析預測。各實驗因素與響應面值的關系不是簡單的線性關系，其中C、AD、BC、A2、B2、C2、D2對骨碎補總黃酮提取率影響非常顯著，A為高度顯著，D為顯著，其他不顯著，各因素對指標的影響大小順序為C＞A＞D＞B。

圖1 超聲時間、提取溫度、乙醇體積分數及料液比對總黃酮提取率的影響

表1 響應面分析因素水平及編碼

表2 響應面分析試驗設計及結果

表3 回歸模型的方差分析

2.6 響應面圖分析各因素間交互作用對骨碎補總黃酮提取率的影響，見圖2?？煽闯龀晻r間（A）和料液比（D）交互影響非常顯著，表現為曲面陡峭，響應值變化較大，等高線為橢圓形；提取溫度（B）和乙醇體積分數（C）的交互作用影響次之；其他因素交互作用的影響均不顯著。

2.7 驗證實驗由Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到最佳的提取工藝為：超聲時間29.53 min、提取溫度66.30℃、乙醇體積分數64.31%、料液比1∶91.71，骨碎補總黃酮提取率理論值為4.90%。為方便實際操作，將提取工藝修正為：超聲時間30 min、提取溫度66℃、乙醇體積分數64%、料液比1∶92，根據此條件，進行3次平行驗證實驗，骨碎補總黃酮實際提取率分別為4.84%、4.91%、4.82%，平均值為4.86%，RSD為0.97%，與理論值相對誤差為0.81%，表明該提取工藝穩定可行，具有實用價值。

3 討論

在前期實驗中，考察了不同溶劑（甲醇、乙醇）和不同提取次數對總黃酮提取率的影響，結果表明不同溶劑提取率沒有顯著差別，而且提取次數增多，提取率略有增加但變化不大，故從工業化生產以及經濟效益方面考慮，最后確定以乙醇為提取溶劑，提取2次。

在單因素試驗中，對超聲時間進行考察，從圖1A可知，在提取時間10～30 min時，總黃酮提取率隨時間延長而升高，但超過30 min時，總黃酮提取率隨時間增加而降低，原因可能是由于提取時間過長，乙醇揮發增多，總黃酮溶出減少；同時超聲時間太長，使骨碎補黃酮類化合物結構被破壞，從而導致提取率減少。對料液比進行考察，從圖1D可知，在1∶50～1∶90，隨著料液比的增加，總黃酮提取率呈上升趨勢，當超過1∶90時，總黃酮提取率下降，分析其可能由于料液比增大，雜質的溶解也同時增多，反而使總黃酮提取率下降。

本實驗在單因素試驗結果基礎上，采用Box-Behnken試驗設計以及響應面分析法對骨碎補總黃酮的超聲提取工藝進行優選，得出最佳工藝條件為：超聲時間30 min、提取溫度66℃、乙醇體積分數64%、料液比1∶92。在此工藝條件下，總黃酮提取率可達4.86%。該實驗結果對骨碎補總黃酮的提取研究有一定的參考價值，為骨碎補的資源開發提供實驗依據。

圖2 各因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應面圖和等高線圖

［1］劉劍剛，謝雁鳴，趙晉寧，等.骨碎補總黃酮膠囊對實驗性骨質疏松癥和鎮痛作用的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2004，10（5）：31-34.

［2］孫金谞，何偉濤，劉康，等.骨碎補總黃酮與骨質疏松癥的研究［J］.中國骨質疏松雜志，2008，14（10）：763-766.

［3］全紅，郭春秋，曲倩文，等.骨碎補提取工藝的實驗研究［J］.遼寧中醫藥大學學報，2009，11（12）：16-17.

［4］劉健偉，陳勇，熊富良，等.骨碎補總黃酮提取和大孔吸附樹脂純化的工藝研究［J］.中國藥學雜志，2006，41（16）：1222-1224.

［5］周瀅，曾志華.燙骨碎補配方顆粒的提取工藝優選及其含量測定［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，21（5）：54-56.

［6］張海茹.注射用骨碎補總黃酮制備工藝及質量控制方法研究［D］.沈陽：沈陽藥科大學，2007：20-30.

［7］彭曉霞，路莎莎.響應面優化法在中藥研究中的應用和發展［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（19）：296-299.

［8］李曉斌，陳振斌，楊旸，等.響應面分析法優化槐葉中黃酮類化合物的提取工藝［J］.中國藥房，2015，26（7）：960-964.

［9］楊中林，韋英杰，何執靜，等.骨碎補不同炮制品中總黃酮及柚皮苷含量測定［J］.中國中藥雜志，2001，26（10）：682-684.

R284.1

A

1000-338X（2017）04-0040-03

2017-03-24

李景（1989—），女，藥師，主要從事中藥制劑與分析研究。