解郁合歡湯、血府逐瘀湯、天王補心丹抗抑郁作用初步篩選研究

賈銣，方宇驊，陳喆鳴，陳燕，張淑玲，王玉露

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

解郁合歡湯、血府逐瘀湯、天王補心丹抗抑郁作用初步篩選研究

賈銣，方宇驊，陳喆鳴，陳燕，張淑玲，王玉露

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

目的從解郁合歡湯、血府逐瘀湯和天王補心丹3種復方水煎劑中初步篩選出有潛在抗抑郁效果的復方。方法取健康SPF級雄性KM小鼠50只，根據曠場試驗結果隨機分成空白組、鹽酸氟西汀組、解郁合歡湯組、血府逐瘀湯組和天王補心丹組5組，每日灌胃給藥1次，連續給藥14 d。每周進行懸尾試驗、強迫游泳試驗觀測小鼠行為學變化；給藥結束后測定小鼠自發活動；行為學試驗結束后，用Western Blot法測定小鼠海馬p-GSK3β的表達量。結果①與空白組相比，血府逐瘀湯組和天王補心丹組在給藥第1周和第2周均能顯著縮短小鼠懸尾和游泳不動時間，作用與鹽酸氟西汀組相當，其中天王補心丹組作用最顯著；解郁合歡湯組有作用趨勢，但無顯著性差異。②3種復方均不影響小鼠自發活動。③3種復方均能增加小鼠海馬p-GSK3β的表達量，天王補心丹組作用最顯著。結論天王補心丹抗抑郁效果較強，其作用機制可能與增加海馬p-GSK3β的表達有關。

抗抑郁；行為學；解郁合歡湯；血府逐瘀湯；天王補心丹；Western Blot

抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是當今社會上一種常見的精神疾病，它對患者的行為、思想及精神狀態產生負面、消極的影響［1］。臨床常用的抗抑郁西藥雖然藥效顯著，但有明顯毒副作用，可誘發躁狂、煩躁不安、情緒激動、失眠和行為混亂等問題［2-3］。考慮到抑郁癥治療需要長期用藥，所以探尋毒副作用更小的抗抑郁藥十分重要，傳統中藥或許能對抑郁癥治療提供幫助。

相對于現代抗抑郁藥物，傳統中藥抗抑郁藥物的發展更為緩慢，也更加注重臨床效果。具有抗抑郁效果（或類抗抑郁效果）的中藥復方，按照抑郁癥對應癥狀分類，主要可分為3類，即疏肝解郁類、養心安神類和活血化瘀類。解郁合歡湯出自清代費伯雄的《醫醇剩義》［4］，具有疏肝清火解郁、養血安神功效；血府逐瘀湯出自清代王清任的《醫林改錯》［5］，具有活血祛瘀、行氣止痛功效；天王補心丹出自《世醫得效方》［6］，具有滋陰養血、補心安神功效。

現代醫學所定義的抑郁癥與中醫郁癥相似［7］。解郁合歡湯［8］、血府逐瘀湯［9］、天王補心丹［10］的主治癥皆與抑郁癥的病征相似，結合臨床案例我們推測這3種復方均具有抗抑郁作用。本研究通過探究3種復方對抑郁模型小鼠的行為學和海馬p-GSK3β表達的影響，以期篩選出抗抑郁效果較顯著的復方。

1 材料與藥品

1.1 動物及分組SPF 級KM小鼠，雄性，體質量18～22 g，吳氏實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。小鼠根據體質量隨機分為5組，每組10只，室內適應性飼養7 d后開始正式實驗，自由飲水進食。鹽酸氟西汀組每天給予鹽酸氟西汀（10 mg／kg）灌胃，解郁合歡湯組按照《醫醇剩義·卷二》組方，血府逐瘀湯組和天王補心丹組均按《方劑學》［11］所記載劑量換算成小鼠用量，空白組給予蒸餾水灌胃。每只小鼠給藥量：解郁合歡湯、血府逐瘀湯和天王補心丹分別為6.8 g／kg、7.8 g／kg和13.2 g／kg，每日灌胃1次，連續給藥14 d。

1.2 藥品解郁合歡湯組成：合歡花6 g，郁金6 g，沉香1.5 g，當歸6 g，白芍3 g，丹參6 g，柏子仁6 g，山梔4.5 g，柴胡3 g，薄荷3 g，茯神6 g，紅棗5枚，橘餅12 g。血府逐瘀湯組成：當歸9 g，生地黃9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗4.5 g，川芎4.5 g，牛膝9 g。天王補心丹水煎劑組成：丹參9 g，當歸10 g，人參10 g，茯苓12 g，五味子8 g，麥冬10 g，天冬9 g，生地黃15 g，玄參10 g，遠志9 g，酸棗仁12 g，柏子仁10 g，桔梗8 g。以上藥材均購自福州回春藥店和福州瑞來春堂，經楊成梓教授鑒定均屬《中國藥典》收載藥材。復方水煎劑制備方法：上述藥材適量3倍水浸泡30 min，文火煎煮1 h，過濾，濾液備用；濾渣加入3倍量水煎煮1 h，過濾，合并濾液，濃縮至預設的濃度，藥液于4℃冰箱保存備用。鹽酸氟西汀膠囊（百憂解，禮來蘇州制藥有限公司，批號：1017A），使用蒸餾水配成相應濃度藥液（10 mg／kg）。

1.3 實驗材料懸尾實驗裝置（自制）；強迫游泳實驗裝置（自制）；小鼠曠場箱（自制）。

2 方法

2.1 分組小鼠根據初次曠場實驗結果隨機分為5組：空白組、鹽酸氟西汀組、解郁合歡湯組、血府逐瘀湯組、天王補心丹組，每組10只。

2.2 小鼠懸尾試驗參考文獻［12］，將小鼠尾部距尖端約2 cm（1／3）處用膠帶粘貼于橫桿上，前肢距離臺面約5 cm。錄像記錄6 min內小鼠的掙扎狀況，記錄后4 min內小鼠不動狀態持續的時長。小鼠轉體、扭曲等掙扎行為皆屬于活動狀態；小鼠前肢小幅擺動而軀干及后肢不動視為靜止狀態。該實驗在實驗第6天和第13天給藥1 h后進行。該實驗前不禁食、不禁水。

2.3 小鼠強迫游泳試驗參考文獻［12］，將小鼠置于盛有水的大燒杯中，大燒杯水深18 cm，水浴加熱至并保持水溫為（25±1）℃。對6 min內的小鼠游泳錄像，對后4 min內小鼠活動情況進行分析，記錄后4 min內小鼠不動狀態持續的時長。小鼠游泳等掙扎行為皆屬于活動狀態；小鼠前肢小幅擺動而整體未在水中游動視為靜止狀態。該實驗在實驗第7天和第14天給藥1 h后進行。該實驗前不禁食、不禁水。

2.4 小鼠自發活動測定參考文獻［13］，在行為學測試結束后，在第14天將小鼠放置于小鼠曠場箱內，對5 min內小鼠的自發活動狀況進行觀察。實驗裝置為50 cm×50 cm×40 cm木箱，周壁黑色，底部等分為25方格，分別記錄小鼠水平得分（三爪以上跨入鄰格的次數）和垂直得分（兩前肢離地1 cm以上的次數）。

2.5 Western Blot法檢測小鼠海馬p-GSK3β的表達動物實驗結束后斷頭，在低溫環境下迅速取出小鼠雙側海馬并提取總蛋白，用BCA法測定其蛋白含量。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出目標蛋白后，轉印至硝酸纖維素膜（NC膜）上；將NC膜浸于含5%脫脂奶粉的Tris緩沖液（Tris buffered saline，TBS）中室溫封閉2 h，用含0.05%吐溫20的TBS緩沖液（TBST）漂洗3次，一抗（p-GSK3β 1∶1 000，β-actin 1∶1 000）4℃孵育過夜；TBST漂洗3次，二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，漂洗干凈，凝膠成像儀顯影。采用p-GSK3β與β-actin的吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

2.6 統計學方法采用統計軟件GraphPad Prism 5.0進行數據分析。計量資料屬正態分布以（Means±SEM）表示，采用單因素方差分析（oneway ANOVA）的Dunnett’s檢驗。

3 結果

3.13 種復方對小鼠懸尾不動時間影響見圖1。

圖1 3種復方給藥2周內對小鼠懸尾不動時間影響

3.23 種復方對小鼠強迫游泳不動時間影響見圖2。

圖2 3種復方給藥2周內對小鼠游泳不動時間影響

3.33 種復方對小鼠自發活動影響見表1。

表1 3種復方對小鼠自發活動影響（Means±SEM）次

3.43 種復方對小鼠海馬區p-GSK3β表達影響見圖3。

圖3 3種復方給藥2周后對小鼠海馬區p-GSK3β表達影響

4 討論

天王補心丹在懸尾試驗和強迫游泳試驗中均表現出改善抑郁絕望狀態的效果，并能顯著增加小鼠海馬p-GSK3β的表達，說明天王補心丹有很好的抗抑郁作用，其作用機制可能與影響海馬p-GSK3β的表達有關。

本實驗目的在于對3種可能有抗抑郁效果的中藥復方進行初篩，因此沒有采用慢性應激模型，而是直接采用對正常小鼠給藥并對其進行行為學方法測定來初步斷定藥物是否有抗抑郁效果。懸尾試驗是Stem等［14］介紹的一種較為簡單的評價抗抑郁藥物效果的實驗方法。在某些實驗中，小鼠在不可逃避的應激條件下，表現出的不動狀態反映了放棄求生動作的絕望行為，這種絕望行為可模擬出人類的抑郁狀態。根據此原理，研究者采用小鼠懸尾試驗，從而復制出小鼠的絕望行為模型，用以評價抗抑郁藥物的作用。懸尾試驗能直接反映小鼠的體能狀態和激惹和絕望程度，也可間接反映小鼠的情志如肝氣肝火盛衰、氣虛程度。強迫游泳試驗是Porsolt等人［15］介紹的一種比較直觀評價抗抑郁藥物的試驗方法。強迫游泳試驗能通過小鼠靜止時間直觀地反映小鼠的體能和絕望程度，也是一種評價小鼠虛證乏力狀態的理想試驗方法。本研究測試中發現：3種復方均有一定程度的抗抑郁效應，并且從第1周就開始有效，其中血府逐瘀湯和天王補心湯作用優于解郁合歡湯，而天王補心丹在懸尾試驗中表現出了顯著的抗抑郁作用優勢，可篩選為進一步研究的抗抑郁藥物。為了避免假陽性結果，我們還進行了小鼠曠場試驗以驗證藥物對小鼠的自發活動沒有影響，說明其不動時間的縮短并非藥物的中樞興奮作用引起的。

腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）被視為神經可塑性的標志［16］，可促進神經元的成長和分化，并參與調控神經元形成神經網絡的整個過程，是抑郁癥發病和治療的關鍵因素。隨著對抑郁癥發病機制的深入研究，新近在BDNF相關信號通路研究中，糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）的作用越來越受到矚目。研究發現抑郁癥死亡患者大腦前額皮層的GSK3β活性升高，并伴隨Akt活性的降低［17］；臨床上能夠升高大腦5-HT水平的抗抑郁藥例如單胺氧化酶抑制劑、氟西汀、丙咪嗪還有5-HT本身能夠增強GSK3β的磷酸化；基因阻斷小鼠抑制GSK3β磷酸化過程可抵消抗抑郁藥氟西汀的促神經元再生作用［18］；雜合子GSK3β敲除小鼠在強迫游泳試驗和懸尾試驗中表現出抗抑郁樣行為［19］；選擇性GSK3β抑制劑能在抑郁癥動物模型上產生抗抑郁作用并促進神經元再生［20－21］。這些都預示著這一機制在抗抑郁藥物治療過程中可能起著相關作用，GSK3β有可能成為抗抑郁治療的重要潛在的靶標。因而近年來圍繞與GSK3β相關的抑郁細胞信號通路也越來越受到研究者的關注，主要有兩種信號通路：Wnt／GSK3β／β-catenin信號通路和PI3K／AKt／GSK3β信號通路，其中p-GSK3β可抑制GSK3β的活性，使BDNF表達增強。

本實驗擬在行為學篩選的基礎上探索藥物的抗抑郁機制，研究發現3種復方對小鼠海馬p-GSK3β表達均有增強，以天王補心丹作用最為顯著。因此我們得出結論：天王補心丹有較好的抗抑郁效應，其抗抑郁機制可能與GSK3β信號通路有關。

［1］BELMAKER R H，AGAM G.Major depressive disorder［J］.N Engl J Med，2008，358（1）：55-68.

［2］BIRMES P，COPPIN D，SCHMITT L，et al.Serotonin syndrome：a brief review［J］.CMAJ，2003，168（11）：1439-1442.

［3］BOYER E W，SHANNON M.The serotonin syndrome［J］.N Engl J Med，2005，352（11）：1112-1120.

［4］邵文虎.解郁合歡湯治療抑郁癥舉隅［J］.河北中醫，1996，18（5）：33-34.

［5］李繼娥.名方“血府逐瘀湯”臨床應用研究［J］.亞太傳統醫藥，2013，9（11）：2.

［6］葉琳.天王補心丹臨床應用研究概況［J］.時珍國醫國藥，2009，20（2）：507-508.

［7］李青，聶皎.抑郁癥中醫病機再認識［J］.云南中醫中藥雜志，2013，34（8）：85.

［8］張光茹，孫巧，王界成，等.解郁合歡湯治療抑郁癥的臨床觀察［J］.青海醫藥雜志，2009，39（8）：84-85.

［9］孫燕霞，李淑萍.活血化瘀法治療腦卒中抑郁臨床療效觀察［J］.中國醫療前沿，2013，8（9）：89，111.

［10］范海燕.產后抑郁癥中西醫結合治療的研究［J］.醫學信息，2011，24（2）：772-773.

［11］謝鳴.方劑學［M］.北京：人民衛生出版社.2016：206，240.

［12］WANG Y L，WANG J X，HU X X，et al.Antidepressant-like effects of albiflorin extracted from Radix paeoniae Alba［J］.J Ethnopharmacol，2016（179）：9-15.

［13］WANG Q S，DING S L，MAO H P，et al.Antidepressant-like effect of ethanol extract from Zuojin Pill，containing two herbal drugs of Rhizoma Coptidis and Fructus Evodiae，is explained by modulating the monoaminergic neurotransmitter system in mice［J］. J Ethnopharmacol，2013，148（2）：603-609.

［14］STERU L，CHERMAT R，THIERRY B，et al.The tail suspension test：a new method for screening antidepressants in mice［J］. Psychopharmacology（Berl），1985，85（3）：367-370.

［15］PORSOLT R D，LE PICHON M，JALFRE M.Depression：a new animal model sensitive to antidepressant treatments［J］.Nature，1977，266（5604）：730-732.

［16］CALABRESE F，MOLTENI R，RACAGNI G，et al.Neuronal plasticity：a link between stress and mood disorders［J］.Psychoneuroendocrinology，2009，34（Suppl 1）：S208-216.

［17］KAREGE F，PERROUD N，BURKHARDT S，et al.Alteration in kinase activity but not in protein levels of protein kinase B and glycogen synthase kinase-3beta in ventral prefrontal cortex of depressed suicide victims［J］.Biol Psychiatry，2007，61（2）：240-245.

［18］EOM T Y，JOPE R S.Blocked inhibitory serine-phosphorylation of glycogen synthase kinase-3alpha／beta impairs in vivo neural precursor cell proliferation［J］.Biol Psychiatry，2009，66（5）：494-502.

［19］BEAULIEU J M，MARION S，RODRIGUIZ R M，et al.A betaarrestin 2 signaling complex mediates lithium action on behavior［J］.Cell，2008，132（1）：125-136.

［20］KAIDANOVICH-BEILIN O，MILMAN A，WEIZMAN A，et al. Rapid antidepressive-like activity of specific glycogen synthase kinase-3 inhibitor and its effect on beta-catenin in mouse hippocampus［J］.Biol Psychiatry，2004，55（8）：781-784.

［21］LANGE C，MIX E，FRAHM J，et al.Small molecule GSK-3 inhibitors increase neurogenesis of human neural progenitor cells［J］. Neurosci Lett，2011，488（1）：36-40.

R285.5

A

1000-338X（2017）04-0031-03

2017－03－10

福建省教育廳中青年教育科研項目課題（JAT160235）；福建中醫藥大學校管課題（X2015026）

賈銣（1978—），女，實驗師，主要從事中藥神經精神藥理學研究。

王玉露（1975—），女，醫學博士，副教授。E-mail：luoyang5466@163.com