球形孢子絲菌與孢子絲菌屬其它模式菌株的形態特征差異

趙明丹，周 汛

（重慶市中醫院皮膚美容科，重慶 400012）

球形孢子絲菌與孢子絲菌屬其它模式菌株的形態特征差異

趙明丹，周 汛*

（重慶市中醫院皮膚美容科，重慶 400012）

目的 比較菌絲相下球形孢子絲菌與孢子絲菌屬其它菌種的形態特征差異，探討鑒定球形孢子絲菌的形態學。方法 分別接種15株從臨床分離的中國球形孢子絲菌和6株其它孢子絲菌屬模式菌株，用光學顯微鏡從菌落、菌絲、孢子形態及生長速度進行比較。結果 球形孢子絲菌鏡下形態為球形或倒梨型，申克孢子絲菌模式菌株鏡下呈長桿狀；臨床分離菌株生長緩慢，環境菌株生長較快。結論 球形孢子絲菌與孢子絲菌屬其他菌種在菌落顏色、生長速度、鏡下菌絲、孢子均存在差異，為臨床快速有效鑒別孢子絲菌菌種奠定基礎。

孢子絲菌；菌落特點；形態學

孢子絲菌病是由申克孢子絲菌引起的一種急性或慢性皮膚及皮下組織的真菌感染性疾病，可由呼吸道、被污染的土壤及植物、患病動物咬傷等傳染致病，臨床常表現為皮膚化膿、潰爛及滲出，咳嗽、發熱等，臨床分型可分為皮膚型和系統型，后者可累及骨、肺、眼等多個器官[1]。臨床上常需進行全身性治療，除口服抗真菌藥物外，局部外用光動力可縮短口服藥物療程，減少不良事件發生。我國東北地區為此病好發區域，長久以來我國各地區孢子絲菌病的病原菌一直被認為是申克孢子絲菌，近來研究表明我國孢子絲菌病的致病菌是球形孢子絲菌[2-3]。本實驗通過比較球形孢子絲菌與其它孢子絲菌的生物學形態差異，為鑒定球形孢子絲菌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 15株從臨床分離菌株，6株購買自荷蘭CBS真菌多樣性研究中心孢子絲菌其它模式菌株：環境分離菌種：墨西哥孢子絲菌模式菌株（CBS 120341），Sporothrix humicola（CBS 118129），Sporothrix lignivora（CBS 119148）；球形孢子絲菌的模式菌株（CBS 120340），申克孢子絲菌模式菌株（CBS 359.36），申克孢子絲菌盧艾里變種模式菌株（CBS 937.37）。

1.1.2 培養基 2%土豆葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。

1.2 方 法

1.2.1 菌株復蘇 將實驗菌株接種于PDA試管中，每隔7d傳代1次，連續傳代2～3次，觀察鏡下菌落形態，保證菌株的純度和生長活力。

1.2.2 菌株培養 純化后菌株接種在PDA培養基平板中央，接種物直徑2mm，25℃倒置培養28d，每隔7d觀察菌落長勢并測量菌落的生長速度。每組菌落設置3個培養皿，重復測試3次。

1.2.3 玻片小培養 PDA瓊脂塊置于無菌載玻片上，厚度以2～3mm為宜；將菌株接種在瓊脂塊上，置于25℃下培養7天，揭下蓋玻片覆蓋在新載玻片上，光鏡下(100×)進行形態學觀察。

2 結 果

2.1 菌落形態

所有的孢子絲菌均呈現較好的生長菌落生長平整，圓形可見白色絨毛狀菌絲，培養21d時球形孢子絲菌菌落出現皺褶。CBS 359.36和CBS 937.37菌絲為白色，CBS 120341菌絲呈棕色，CBS 118129菌絲為白色，21d時菌落周圍可見一圈白色透明狀絨毛。CBS 119148菌落環狀，背面為黑褐色，菌絲呈墨綠色，隨菌落生長顏色逐漸加深，14d前菌落邊緣可見白色菌絲，21d后變為墨綠色菌絲，見圖1。

2.2 生長速度

我國15株臨床分離菌株及CBS 120340及CBS 359.36，CBS 937.37生長較慢；CBS 120341、CBS 118129、CBS 119148均為環境分離菌株，生長速度較快，7d、14d、21d、28d時的生長速度均超過臨床分離株，CBS 119148的生長速度最快，21天菌落平均直徑達76mm，見表1、圖2。

圖1 不同菌株培養期間菌落形態在25℃PDA培養基上7天，14，21天和28天菌落形態，從上至下分別為：(a)臨床分離菌株來自北京地區，(b)臨床分離菌株來自吉林地區，(c)臨床分離菌株來自重慶地區， (d)S.globosa(CBS 120340)，(e)S.schenckii(CBS 359.36),(f)S.schenckii var.luriei(CBS 937.72)., (g) S.mexicana(CBS 120341),(h)S.humicola(CBS 118129),(i)S.lignivora(CBS 119148)。

表1 不同菌株培養期間菌落平均直徑（mm）

2.3 鏡下形態

球形孢子絲菌光鏡下在頂端及菌絲兩側均可見呈圓形或倒梨型排列的分生孢子，菌絲兩側附著較少的呈袖套樣分生孢子。CBS 359.36顯微鏡下可見菌絲頂端呈長桿狀排列的分生孢子，在菌絲兩側未見孢子附著。CBS 937.37光鏡下在頂端呈桿狀樣狀排列的小分生孢子。環境菌株CBS 120341、CBS 119148和CBS 118129光鏡下在頂端可見呈排列的長橢圓形的分生孢子。

3 討 論

本次研究發現，來自環境菌株的孢子絲菌比臨床分離的孢子絲菌生長速度快，7d，14d，21d，28d時的生長速度均超過臨床分離株，從環境分離而來的模式菌株CBS 119148的生長速度最快，21天菌落平均直徑達76mm，菌落顏色呈墨綠色。而來自臨床分離菌株生長速度較慢，我國臨床型孢子絲菌分離菌株21天菌落平均直徑為41mm，菌落顏色為棕色或白色，環境菌株21天菌落直徑均＞50mm，而臨床菌株21天時菌落直徑均＜50mm[4]。孢子絲菌菌落顏色越深說明產生的孢子越多，致病性越強[5,6]。本實驗菌落顏色較深的是我國臨床分離株和Sporothrix lignivora[7,8]，故本次研究考慮以上兩種菌株毒力最強；在我國三個地區分離的孢子絲菌中，來自重慶和北京地區的孢子絲菌菌落顏色棕白色，而吉林地區的孢子絲菌菌落顏色呈黑色，表面皺褶，說明我國不同地區的球形孢子絲菌孢子形態存在差異，且吉林地區孢子絲菌致病力更強，與之前研究顯示我國東北地區為孢子絲菌好發區域情況相吻合，提示臨床可根據疾病發生區域推測菌種類型，從而減少檢查人員工作量，提高診斷效率。

我們發現球形孢子絲菌鏡下頂端孢子以圓形、倒卵圓形或梨形固著分生孢形為特點，而申克孢子絲菌鏡下頂端孢子以長桿狀為特點，這也許是在鏡下區別孢子絲菌兩個種的要點。本次研究證明，在臨床上可以通過小培養觀察頂端分生孢子形態，測量菌落直徑來鑒別孢子絲菌種。

綜上所述，孢子絲菌的多樣性導致了孢子絲菌屬的不同特征，本實驗通過菌株的生物學特性對孢子絲菌屬進行區別，為孢子絲菌提供了臨床研究基礎，從而快速有效地鑒定菌種，從而指導臨床治療方案及預后判斷。

[1] 李聰慧,冉玉平,王鵬等.發生于雙側腰部的孢子絲菌病1例 [J].中國真菌學雜志,2012,07(1)∶31-32.

[2] 黃夢雅,劉婷婷,楊致邦等.16株中國東北地區臨床孢子絲菌菌種分子生物分類學研究[J].中國人獸共患病學報,2014,30(9)∶904-908.

[3] 譚靜文,劉偉,萬喆等.來自中國北方部分地區33株孢子絲菌菌株的表型和基因型鑒定[J].菌物學報,2013,32(2)∶161-167.

[4] 劉婷婷.中國地區臨床孢子絲菌的系統發育分析[D].重慶醫科大學,2014.

[5] 畢云斐,齊琳,李福秋等.孢子絲菌病及影響申克孢子絲菌毒力因素的研究進展[J].中國老年學雜志,2015,(8)∶2301-2303.

[6] 賀羽,黃宜進,趙秘密等.中國臨床球形孢子絲菌菌絲相藥物敏感性分析[J].中國真菌學雜志,2016,11(4)∶209-212.

[7] 賀羽,黃夢雅,胡青碧等.中國南北方地區臨床孢子絲菌菌種鑒定[J].中國真菌學雜志,2015,10(5)∶279-282.

[8] 劉婷婷. 中國地區臨床孢子絲菌的系統發育分析[D]. 重慶醫科大學, 2014.

The difference of morphological characteristics among Chinese clinical strains and the others of Sporothrix schenckii complex

ZHAO Ming-dan, ZHOU Xun
(Department of dermatology, Chongqing Hospital of traditional Chinese Medicine, Chongqing City, 400016, China)

Objective Comparison of morphological characteristics of spherical mycelial phase of Sporothrix schenckii and other strains of Sporothrix,to investigate the morphological identification method of spherical sporotrichosis. Methods 15 strains isolated from clinical isolates of Sporothrix China spherical bacteria and 6 strains of other Sporothrix strains were inoculated; The colony, hyphae, spore morphology and growth rate were compared by light microscopy. Results The spherical Sporothrix morphology under microscope for spherical or inverted pear, and Sporothrix schenckii strains under microscope were rod-shaped. The clinical isolates grew slowly and the environmental isolates grew rapidly. Conclusion There are differences in the color of colonies, the growth rate, the microscopic hyphae and the spores of other species, which lays the foundation for the rapid and effective identification of filamentous bacteria.

Sporothrix; Colonies Features; Morphological

圖2 不同菌株培養期間菌落直徑

圖3 不同菌株培養期間鏡下形態在25℃PDA培養基上7天鏡下孢子形態（100X）A∶臨床分離菌株來自北京地區，B∶臨床分離菌株來自吉林地區，C∶臨床分離菌株來自重慶地區，D∶S.globosa(CBS 120340)，E∶S.schenckii(CBS 359.36), F∶S.schenckii var.luriei(CBS 937.72).,G∶S.mexicana(CBS 120341), H∶S.humicola(CBS 118129), I∶S.lignivora(CBS 119148)。

國家自然科學基金（No. 31270062）

趙明丹（1985—），女，碩士，主治醫師，研究方向：醫學真菌學。

周汛（1970—），女，博士，教授、主任醫師，研究方向：醫學真菌學。

DOI∶ 10.19593/j.issn.2095-0721.2017.08.039