纖溶酶注射液對糖尿病腎病大鼠的治療作用及機制研究

孟凡彩　李海靜　趙振瑩

【摘要】 目的 探討纖溶酶注射液（FI）對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的大鼠糖尿病腎病（DN）的治療作用及機制。方法 40只SD大鼠， 隨機分成正常對照組（NC組， 10只）和研究組（30只）。研究組采用STZ注射誘導大鼠模型成功20只， 隨機分為DN組和DN+FI組， 各10只。DN+FI組大鼠用FI每日尾靜脈注射， 對DN組大鼠進行連續8周治療。每日觀察各組大鼠的一般狀況， 計算腎臟臟器系數， 光鏡檢查腎組織形態改變， 生化法檢測尿蛋白（UP）量、血清超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性， 蛋白質印跡法檢測腎皮質組織中纖溶酶原活化抑制因子-1 （PAI-1）蛋白的表達量。結果 經FI治療后， DN組大鼠的一般狀況逐漸接近正常， 腎臟臟器系數降低， UP量減少， 腎組織病理變化明顯改善， 與NC組比較， DN組大鼠血清的SOD、CAT活性明顯降低， UP含量明顯增加， 差異具有統計學意義（P<0.05）。而與DN組大鼠比較， DN+FI組大鼠的SOD、CAT活性顯著提高， UP含量明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 FI對STZ誘導的DN大鼠腎臟具有明顯的保護作用， 其機制可能與其提高機體抗氧化能力、降低腎組織PAI-1蛋白表達有關。

【關鍵詞】 纖溶酶注射液；糖尿病腎病；大鼠；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；纖溶酶原活化抑制因子-1

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.20.107

糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）是糖尿病（diabe?tesmellitus， DM）最主要的微血管并發癥， 也是導致慢性腎衰竭的主要原因之一。DM病程10年以上者約50%并發DN。每年新增終末腎病中， DN所占比例逐年升高[1]。DN早期的主要病理特征是腎小球肥大， 腎小球和腎小管基底膜增厚、系膜區細胞外基質的進行性積聚以及微血栓的形成。后期為腎小球、腎小管間質的纖維化， 最終導致蛋白尿和腎功能衰竭。氧化應激是導致DM慢性并發癥的最根本原因之一[2]。由于DN患者體內糖代謝紊亂， 持續清除活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutas， SOD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）等含量明顯降低， 導致氧化應激水平增高， 最終損傷腎組織[3]。凝血和纖溶系統的紊亂也是DN發生的一種重要機制。DN患者體內血液普遍存在的高凝狀態和血管病變與纖溶酶原活化抑制因子-1 （plasminogen activator inhibitor-1， PAI-1）的高表達高度相關[4]， 這提示PAI-1的表達增多在DN發生中發揮重要作用。對DN患者進行早期干預治療具有重要的臨床意義。改善腎微循環是對DN患者早期干預治療的一個重要方面[5]。纖溶酶注射液（fibrinogenase injection， FI）內含纖維蛋白溶解酶， 能夠降低血小板聚集及血液粘度， 改善微循環。纖溶酶注射液常用于治療心血管疾病如動脈硬化性腦病、腦梗死、下肢深靜脈血栓等具有較好的療效[6]。然而， FI用于早期干預治療DN還未有報導。鑒于此， 本文誘導了DN大鼠來研究FI對DN大鼠的治療效果， 并探討可能的機制。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 選取清潔級雄性SD大鼠40只， 8周齡， 體重180～220 g， 購自臨沂市實驗動物中心。動物單籠飼養， 自由攝食、飲水， 飼養室溫度保持在（22±2）℃， 自然光照， 適應3 d后用于實驗。隨機分成正常對照組（NC組， 10只）和研究組（30只）。

1. 2 試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）、SOD、CAT檢測試劑盒均購自Sigma 公司（St. Louis， MO， USA）；尿蛋白（urine protein， UP）考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；FI購自北京賽升藥業股份有限公司；PAI-1小鼠單克隆抗體（C-9）、兔抗鼠IgG-HRP單克隆抗體均購自Santa Cruz 公司（Santa Cruz， CA， USA）。

1. 3 試驗方法 研究組大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg（溶于0.1 mol/L， pH=4.2的無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液中， 終濃度為1%， 現配現用）， 注射72 h后連續3 d大鼠尾靜脈采血檢測血糖。以連續3次血糖濃度>16.7 mmol/L， 尿量>原尿量150%， UP排泄>30 mg/24 h尿者為成模標準。最終， 建模成功的大鼠20只， 成功率67%。NC組大鼠給予等量緩沖液注射。研究組大鼠隨機分為DN組和DN+FI組， 各10只。

1. 4 動物給藥及樣品收集 DN+FI組大鼠采用尾靜脈注射2 U/kg的FI（溶于生理鹽水， 1 U/ml）， 連續給藥8周， NC組和DN組給予等量的生理鹽水。各組實驗大鼠于8周后處死， 處死前1 d代謝籠收集24 h尿液， 記錄尿量， 麻醉后， 稱重、頸動脈取血， 分離血清。尿液、血清置于﹣80℃冰箱保存， 用于檢測生化指標。同時分離腎臟， 用濾紙吸干后稱重， 一側腎臟置﹣80℃冰箱保存供Western blotting檢測用， 部分腎臟以10%中性甲醛固定， 用于組織病理學檢查。

1. 5 組織病理學檢查 經甲醛溶液固定的腎臟組織， 常規酒精脫水、透明、石蠟包埋后， 連續4 μm 切片， 蘇木素伊紅染色（HE）后， 在光鏡下觀察腎臟的組織形態學變化。

1. 6 生化指標測定 檢測UP、血清SOD、CAT的含量， 均按試劑盒的說明書操作。血糖濃度用強生血糖儀測定。

1. 7 蛋白質印跡法 腎皮質組織經充分勻漿， 離心后取上清作為蛋白提取物。等量的蛋白 （50 μg） 在加入上樣緩沖液充分混勻后， 沸水浴煮5 min， 瞬時離心后進行 SDS-PAGE。電泳后的蛋白用恒流濕法轉移到硝酸纖維素膜上。蛋白膜經封阻、洗滌后與PAI-1一抗在4℃孵育雜交過夜。洗膜后加入IgG-HRP二抗， 在室溫下孵育雜交2 h。蛋白膜洗滌后， 在膜的蛋白面滴加等比例混合 ECL 檢測液 A 和 B， 用 Bio-Rad ChemiDocXRS （Hercules， CA， USA） 曝光， 截獲圖像。endprint

1. 8 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 一般狀況 DN組注射STZ誘導DM后， 進食量在病變初期增加， 病變后期食量減少、尿頻且量多、體重減輕、生長緩慢、毛發枯槁發黃等狀況。而NC組大鼠食量、飲水、尿量及精神狀態基本正常。經FI治療后， DN+FI組大鼠的飲水、食量、尿量、體重、毛發均逐漸接近正常。

2. 2 臟器系數 與NC組大鼠比較， DN組大鼠其臟器系數顯著增加， 經DN+FI組大鼠臟器系數明顯降低。

2. 3 腎組織病理變化 病理組織學檢查顯示， DN組大鼠腎小球充血水腫明顯， 體積增大， 腎小管上皮細胞變性壞死脫落， 基底膜破壞， 部分結構不清。DN+FI組大鼠腎組織結構明顯改善， 只表現為輕微的充血， 管腔分開， 基底膜完整， 結構清晰， 腎小球和腎小管結構接近正常。見圖1。

2. 4 血清中SOD、CAT、UP情況 與NC組比較， DN組大鼠血清的SOD、CAT活性明顯降低， UP含量明顯增加， 差異具有統計學意義（P<0.05）。而與DN組大鼠比較， DN+FI組大鼠的SOD、CAT活性顯著提高， UP含量明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 5 腎皮質組織中PAI-1蛋白表達 各實驗組大鼠腎皮質組織中均可檢測到PAI-1蛋白的表達。DN組大鼠腎皮質組織中PAI-1的表達量明顯高于NC組大鼠。相對于DN組大鼠， DN+FI組其腎皮質組織中PAI-1的表達量顯著降低。見圖2。

3 討論

DN是DM常見而嚴重的微血管并發癥， 與血栓形成密切相關， 改善微循環是治療DN的一個重要方面。臨床上已經證實FI可以改善纖溶系統的功能， 在治療動脈硬化性腦病、腦梗死、下肢深靜脈血栓等疾病時獲得了較好的效果。然而， FI用于早期干預治療DN卻未見報導。在本研究中， 通過建立DN大鼠模型來初步探討FI對DN的治療作用及其可能的機制。

采用FI對DN大鼠模型進行8周的治療后發現， DN大鼠的主要癥狀和腎臟病理改變均得到很大的改善。經過治療后， DN大鼠的飲水、食量、尿量、體重、毛發均逐漸接近正常， 臟器系數明顯降低。病理組織學檢查顯示， 治療后DN大鼠腎組織結構明顯改善， 只表現為輕微的充血， 管腔分開， 基底膜完整， 結構清晰， 腎小球和腎小管結構接近正常。這說明FI對DN大鼠的干預治療是有效的。以往的臨床實驗已經證實， FI治療血栓行心血管疾病效果明顯， 且不降解凝血因子、補體、血漿蛋白等， 出血并發癥少， 是直接作用于血栓病灶的溶栓藥物， 安全性高[7]。但FI是否真正能夠應用于臨床上治療DN還需要嚴格的臨床實驗來證實。

近年來越來越多的證據表明氧化應激是各種途徑導致DN病變的共同機制。在本研究中， 用FI對DN大鼠模型進行治療后， 其血清中抗氧化酶SOD、CAT活性顯著提高。這提示DN大鼠體內的氧化應激狀態得到明顯的改善， FI可能通過提高DN大鼠體內的抗氧化能力的機制來保護腎臟。PAI-1主要由血管內皮細胞合成， 可抑制纖溶酶原的活化， 降低腎小球和腎小管間質細胞外基質的降解， 促進組織細胞外基質的積聚， 加速DN的發生[8-10]。本研究結果顯示， DN大鼠在經FI治療后， 其腎皮質組織中PAI-1的表達量顯著降低。這提示FI對DN大鼠的治療作用可能是通過抑制PAI-1的表達， 促進纖溶酶原的活化， 從而加快腎小球和腎小管間質細胞外基質的降解的機制來實現。

參考文獻

[1] 李陽. 糖尿病腎病的發病機制及治療進展. 當代醫學， 2010， 16（26）：18-20.

[2] 崔洪臣. 氧化應激與糖尿病腎病. 臨床內科雜志， 2015， 32（1）：

65-66.

[3] Ibrahim DS， Abd El-Maksoud MA. Effect of strawberry （Fragaria ×ananassa） leaf extract on diabetic nephropathy in rats. Int J Exp Pathol， 2015， 96（2）：87-93.

[4] Xue C， Nie W， Zhou C， et al. 4G/4G polymorphism of plasminogen activator inhibitor-1 gene increases the risk of diabetic nephropathy. Renal Failure， 2014， 36（3）：332-338.

[5] 潘素芳， 武寶玉. 糖尿病腎病與微循環. 中華糖尿病雜志， 1998（4）：201-203.

[6] 王定超， 陳文利， 王劍峰. 纖溶酶注射液治療皮質下動脈硬化性腦病的臨床觀察. 當代醫學， 2009， 15（18）：105-106.

[7] 劉文鋒. 纖溶酶注射液治療腦梗死的療效觀察.基層醫學論壇， 2006， 10（9）：797-798.

[8] Lee HB， Ha H. Plasminogen activator inhibitor-1 and diabetic nephropathy. Nephrology， 2005， 10 Suppl（s2）：S11.

[9] 雷作熹， 羅仁， 董曉蕾，等. STZ誘導糖尿病腎病大鼠模型的建立. 中國實驗動物學報， 2005， 13（3）：163-165.

[10] 徐穎， 周世文， 湯建林，等. 實驗性糖尿病腎病大鼠模型建立及優化. 第三軍醫大學學報， 2006， 28（22）：2247-2249.

[收稿日期：2017-04-28]endprint