柿葉黃酮治療實驗性口腔潰瘍的作用及其抗炎機制研究

張永麗　王朔　郝麥玲

【摘要】 目的 探討柿葉黃酮對大鼠口腔潰瘍的治療作用及其抗炎機制。方法 60只SD大鼠， 分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組及柿葉黃酮20、40、80 mg/kg組， 每組10只。空白對照組不做處理， 其他各組建立口腔潰瘍大鼠模型（醋酸法）， 空白對照組、模型對照組給予灌胃等體積生理鹽水， 陽性對照組給予灌胃西瓜霜， 柿葉黃酮組給予灌胃相應劑量柿葉黃酮。比較造模后第4、7天的潰瘍面積， 測定潰瘍組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。結果 用藥后4、7 d， 陽性對照組、柿葉黃酮40 mg/kg

組、柿葉黃酮80 mg/kg組大鼠的潰瘍面積均小于模型對照組， 差異具有統計學意義 （P<0.05）。模型對照組（66.5±4.1）ng/L、陽性對照組（38.7±4.7）ng/L、柿葉黃酮組[（40.2±3.8）、（35.8±4.6）、（32.6±3.8）ng/L]大鼠潰瘍組織內TNF-α水平高于空白對照組（27.8±3.2）ng/L， 差異具有統計學意義 （P<0.05）。陽性對照組、柿葉黃酮組大鼠潰瘍組織內TNF-α水平低于模型對照組， 差異具有統計學意義 （P<0.05）。結論 柿葉黃酮對醋酸誘導的口腔潰瘍有一定的治療作用， 其機制可能與降低炎癥反應有關。

【關鍵詞】 柿葉黃酮；口腔潰瘍；氧化應激；炎癥

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.20.103

【Abstract】 Objective To investigate the therapeutic effect of persimmon leaf flavonoid on oral ulcer in rats and its anti - inflammatory mechanism. Methods A total of 60 SD rats were divided into blank control group， model control group and positive control group， persimmon leaf flavonoid 20， 40 and 80 mg/kg group， with 10 rats in each group. The blank control group received no treatment， and the other groups established the models of rat oral ulcer （acetic acid）. Blank control group， model control group was treated with intragastric administration of equal volume normal saline， the positive control group was treated with intragastric administration of watermelon frost， and persimmon leaf flavonoid group was treated with intragastric administration of corresponding dose persimmon leaf flavonoid. The ulcer area was compared after 4 and 7 days of modeling， and the level of tumor necrosis factor-α （TNF-α） in ulcer tissue was measured. Results After 4 and 7 d of medication， the positive control group， persimmon leaf flavonoid 40 and 80 mg/kg group had smaller ulcer area than model control group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. The model group （66.5±4.1） ng/L， positive control group （38.7±4.7） ng/L and persimmon leaf flavonoid group [（40.2±3.8）， （35.8±4.6） and （32.6±3.8） ng/L] had higher TNF-α level in ulcer tissue than bland control group （27.8±3.2）ng/L， and their difference had statistical significance （P<0.05）. The positive control group and persimmon leaf flavonoid group had lower TNF-α level in ulcer tissue than model control group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion Persimmon leaf flavonoid have a certain therapeutic effect on acetic acid-induced oral ulcers， and its mechanism may be related to the reduction of inflammatory response.

【Key words】 Persimmon leaf flavonoid； Oral ulcer； Oxidative stress； Inflammationendprint

口腔潰瘍（oral ulcer）是口腔黏膜病中最常見的疾病， 以復發性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer， ROU）為主， 一般人群中的發病率可達20%[1]。復發性口腔潰瘍的臨床特征有：致痛性、自限性和反復發作等。患者常由于疼痛而導致咀嚼、飲水、吞咽以及說話困難， 嚴重降低患者的生活質量[2]。復發性口腔潰瘍的病因目前尚不明確， 由于復發性口腔潰瘍病因和病機的復雜性， 導致臨床上缺乏特效治療藥物[3]。在復發性口腔潰瘍的病因和病機中， 炎癥反應對疾病的發生發展發揮著重要作用[4]。柿葉黃酮（persimmon leaf flavonoid， PLF）是柿葉中的主要有效成分。據明代《滇南本草》記載“經霜葉敷臁瘡”， 臁瘡即為小腿的一種慢性潰瘍， 由此提示外用柿葉可用于治療潰瘍。現代藥理學研究發現， 柿葉黃酮具有抗氧化、抗炎等多種藥理作用[5]。基于上述理論基礎， 作者通過建立口腔潰瘍模型， 進行柿葉黃酮的藥物干預， 觀察柿葉黃酮的療效并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 SPF級健康SD大鼠60只， 體重200～240 g， 雌雄各半， 購于北京維通利華實驗動物技術有限公司， 合格證號為SCXK（京）2012-0001。飼養1周， 以適應新環境。12 h晝夜交替， 室溫20～25℃， 濕度為40%～60%， 普通飼料喂養， 自由飲水。

1. 2 試劑和藥品 柿葉黃酮由陜西慈緣生物技術有限公司提供；桂林西瓜霜（桂林三金藥業股份有限公司 ， 國藥準字Z45021599）；TNF-α Elisa試劑盒（上海朗頓生物技術有限公司， 20161122TG）。

1. 3 主要儀器 小動物麻醉機（瑞沃德生命科技有限公司）；Infinite? 200 PRO酶標儀（瑞士TECAN公司）；低溫高速離心機（德國eppendorf公司）；游標卡尺（上海首豐精密儀器有限公司）。

1. 4 方法

1. 4. 1 大鼠口腔潰瘍模型的制備 參考文獻[6]方法：以戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠， 將50%冰醋酸濾紙片（3 mm×3 mm）置于下切牙唇側穹窿區30 s， 移除濾紙片后觀察受損區變化。空白對照組不做處理。模型大鼠在冰醋酸處理后24 h均出現明顯潰瘍面， 肉眼觀察潰瘍面的黏膜呈凹陷性損傷， 表面為蒼白色， 周圍充血水腫明顯， 口腔潰瘍模型制備成功。

1. 4. 2 實驗分組和給藥 SD大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組及柿葉黃酮20、40、80 mg/kg組， 每組10只。陽性對照組給予灌胃西瓜霜200 mg/kg， 柿葉黃酮各組給予相應劑量的柿葉黃酮， 空白對照組、模型對照組給予灌胃等體積的生理鹽水。于造模后第2天給藥， 連續給藥7 d。

1. 5 觀察指標

1. 5. 1 潰瘍面積的測定[7] 用游標卡尺測量各組模型大鼠給藥前及給藥后第4、7天口腔潰瘍的最大橫徑（d1）及最大縱徑（d2）， 計算潰瘍面積（潰瘍面積=π×d1×d2×1/4， π取值3.14）。

1. 5. 2 樣品處理 末次給藥1 h后， 戊巴比妥鈉麻醉， 先腹主動脈取血， 后取潰瘍面組織。每組留取7只大鼠的正常或潰瘍組織加入9倍量的冷生理鹽水進行勻漿處理， 4℃、3000 r/min離心10 min， 分離上清液， -20℃保存。

1. 5. 3 TNF-α的測定 按試劑盒說明書操作， 測定組織中TNF-α的水平。

1. 6 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用單因素方差分析（One way AVONA）。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 柿葉黃酮對大鼠口腔潰瘍面積的影響 用藥前， 模型對照組、陽性對照組、柿葉黃酮組大鼠的潰瘍面積比較， 差異無統計學意義（P>0.05）。用藥后4、7 d， 陽性對照組、柿葉黃酮40 mg/kg組、柿葉黃酮80 mg/kg組大鼠的潰瘍面積均小于模型對照組， 差異具有統計學意義 （P<0.05）。見表1。

2. 2 柿葉黃酮對口腔潰瘍大鼠潰瘍組織中TNF-α的影響

模型對照組（66.5±4.1）ng/L、陽性對照組（38.7±4.7）ng/L、柿葉黃酮組[（40.2±3.8）、（35.8±4.6）、（32.6±3.8）ng/L]大鼠潰瘍組織內TNF-α水平高于空白對照組（27.8±3.2）ng/L， 差異具有統計學意義 （P<0.05） 。陽性對照組、柿葉黃酮組大鼠潰瘍組織內TNF-α水平低于模型對照組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

復發性口腔潰瘍是人群中最為常見的口腔黏膜疾病， 疼痛和反復發作給患者帶來諸多不便。復發性口腔潰瘍的發病原因目前尚不清楚， 已知與眾多因素如內分泌紊亂、免疫功能失調、創傷、吸煙、應激、非甾體類抗炎藥物的應用、維生素或微量元素的缺乏、遺傳因素等有關[1]。

現代研究發現， 復發性口腔潰瘍屬于一種慢性炎癥性疾病[8]。TNF-α是一種關鍵的炎性細胞因子， 可通過影響內皮細胞的粘附功能和誘導中性粒細胞趨化等作用啟動炎癥反應。目前已經開發出抗TNF-α的藥物， 可以改善難治性復發性口腔潰瘍的癥狀[9， 10]。本次研究發現， 柿葉黃酮20、40、80 mg/kg可顯著的降低潰瘍組織內的TNF-α水平。

近年來針對復發性口腔潰瘍病因的復雜性， 基于天然植物藥效成分的多靶點和多向性， 人們開始從天然產物中尋求治療復發性口腔潰瘍的新藥[11]。已知柿葉黃酮是一種良好的天然抗氧化劑， 除了抗氧化作用外還有抗炎、止血、抗菌等作用[5]。柿葉黃酮的這些藥理學作用可針對復發性口腔潰瘍復雜的病因發揮多向性的治療效果。本研究初步證實柿葉黃酮可用于口腔潰瘍的治療， 其機制可能與抗炎作用有關。對于柿葉黃酮防治口腔潰瘍的其他機制還有待于進一步的研究。endprint

參考文獻

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[收稿日期：2017-04-20]endprint