體外沉默異戊二烯化酶二牛龍牛兒基轉移酶Ⅰ對舌鱗狀細胞癌增殖的影響

王瑩王奇民李敬華韓金宏,4王莉莉巢晨周建華童磊魯旭飛,6周元廖奕翔何宗軒李寧曹蕾劉文君陳正崗,9

1.濰坊醫學院口腔醫學院，濰坊 261021；

2.青島市市立醫院口腔頜面外科；

3.中心實驗室，青島 266071；

4.煙臺市口腔醫院口腔頜面外科，煙臺 264008；

5.南京醫科大學青島臨床學院普外科，青島 266071；

6.即墨市普東衛生院口腔科，青島 266234；

7.大連醫科大學研究生院，大連 116044；8.青島市市立醫院耳鼻喉科，青島 266071；

9.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科，上海 200011

體外沉默異戊二烯化酶二牛龍牛兒基轉移酶Ⅰ對舌鱗狀細胞癌增殖的影響

王瑩1王奇民2李敬華3韓金宏2,4王莉莉3巢晨5周建華2童磊2魯旭飛2,6周元1廖奕翔2何宗軒2李寧7曹蕾7劉文君8陳正崗2,9

1.濰坊醫學院口腔醫學院，濰坊 261021；

2.青島市市立醫院口腔頜面外科；

3.中心實驗室，青島 266071；

4.煙臺市口腔醫院口腔頜面外科，煙臺 264008；

5.南京醫科大學青島臨床學院普外科，青島 266071；

6.即墨市普東衛生院口腔科，青島 266234；

7.大連醫科大學研究生院，大連 116044；8.青島市市立醫院耳鼻喉科，青島 266071；

9.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科，上海 200011

目的研究異戊二烯化酶二牛龍牛兒基轉移酶Ⅰ（GGTase-Ⅰ）在舌鱗狀細胞癌增殖中的作用。方法登錄Genebank確定人GGTase-Ⅰ基因序列，設計3條小干擾RNA（siRNA），并將siRNA轉染至舌癌細胞Cal-27（GGTase-ⅠsiRNA組）。設立空白對照組（只加入轉染試劑，不加入siRNA）和陰性對照組（NC-siRNA）。采用實時定量聚合酶鏈反應和蛋白質免疫檢測轉染后各組細胞GGTase-Ⅰ、RhoA的mRNA和蛋白表達；蛋白質免疫檢測轉染48 h后Cyclin D1、p21的表達變化；細胞增殖活性檢測試劑盒和流式細胞術檢測細胞的增殖活性和細胞周期變化。。結果與陰性對照組和空白對照組相比，GGTase-Ⅰ siRNA 組細胞的GGTase-Ⅰ的mRNA和蛋白表達下降（P＜0.05），RhoA 的mRNA和蛋白表達無明顯改變（P＞0.05）；Cyclin D1的表達下降，p21表達升高，細胞的增殖活性下降，細胞周期發生改變（P＜0.05）。結論 GGTase-Ⅰ siRNA能抑制舌鱗狀細胞癌細胞中GGTase-Ⅰ的表達，抑制細胞增殖，提示GGTase-Ⅰ在舌鱗狀細胞癌增殖中可能發揮重要作用。

異戊二烯化酶二牛龍牛兒基轉移酶Ⅰ； RhoA； 舌鱗狀細胞癌； 增殖； Cyclin D1； p21

Rho家族蛋白是小G蛋白Ras超家族成員，具有GTP酶活性，是已知的與腫瘤密切相關的蛋白[1]。研究[2]證實，Rho家族蛋白在多種腫瘤中高表達，參與調節細胞肌動蛋白骨架、細胞極性、基因表達和細胞周期等，與腫瘤細胞的增殖密切相關。Rho家族蛋白需要通過異戊二烯化酶二牛龍牛兒基轉移酶Ⅰ（geranylgeranyltransferaseⅠ，GGTase-Ⅰ）對其羥基端氨基酸序列進行翻譯后修飾，使蛋白正確地定位于胞膜上才能正常發揮功能[3]。因此，GGTase-Ⅰ在Rho蛋白發揮生物活性的過程中起到關鍵作用。近年來關于Rho家族特別是RhoA蛋白及其下游蛋白對癌癥的作用的研究較多，但對于GGTase-Ⅰ在癌癥特別是舌癌中的作用研究較少。

本研究應用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術，通過體外設計合成人舌鱗狀細胞癌細胞株Cal-27 GGTase-Ⅰ基因的siRNA并轉染進入細胞，觀察小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNA）對GGTase-Ⅰ的抑制作用，探討其對舌癌細胞增殖的影響，為GGTase-Ⅰ在舌癌治療中的應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

人舌鱗狀細胞癌細胞株Cal-27購自中南大學高等研究中心。

胎牛血清（Gibco公司，美國），1640培養基、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國），DMSO（Amresco公司，美國），RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、SuperRealPreMix Plus （SYBR Green ） FP 205（北京天根生化科技有限公司），實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物GGTase-Ⅰ、RhoA設計合成（TAKARA公司，日本），實時定量PCR內參磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）（上海生工生物工程股份有限公司），siRNA片段設計合成、轉染試劑（廣州市銳博生物科技有限公司），鼠抗人GGTase-Ⅰ、RhoA（Santa公司，美國），兔抗人GAPDH、Cyclin D1、p21、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG二抗（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），細胞增殖活性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（上海七海復泰生物科技有限公司），細胞周期與凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞培養選用含10%胎牛血清、青霉素100 mg·mL-1和鏈霉素100 mg·mL-1的1640培養基，置于37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱中培養。待細胞鋪滿瓶底后，棄原培養液，PBS沖洗2次，加入1.0 mL 0.25%胰蛋白酶放于孵育箱內約5 min，顯微鏡下觀察，發現細胞胞質回縮、間隙增大，加入等體積的含血清的培養基終止消化，將所有液體移入15 mL離心管內，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，離心管內加入12 mL培養基，反復吹打直至單細胞懸液。計數，按1∶2比例傳代接種在新的培養瓶中。

1.2.2 GGTase-ⅠsiRNA的合成 登錄Genebank確定人GGTase-Ⅰ的基因序列，序列號為NM_005023.3，針對基因序列設計3條siRNA（表1）。

1.2.3 siRNA轉染沉默GGTase-Ⅰ基因 轉染前1 d按每孔5×105個將處于對數生長期的Cal-27細胞接種于6孔板中，每孔加入2 mL不含抗生素的培養基。轉染時細胞密度為30%～50%。120 μL 1×riboFECT?CP Buffer稀釋5 μL 20 μmol·L-1siRNA儲存液，輕輕混勻。加入12 μL riboFECT? CP試劑，輕輕吹打混勻，室溫孵育0～15 min。棄原培養基，PBS沖洗3遍，每孔加入1 863 μL含血清培養基，將riboFECT?CP混合液加入到細胞培養基中，使siRNA終濃度為50 nmol·L-1，輕輕混勻。將培養板置于37 ℃的CO2孵育箱中培養。實驗組為轉染GGTase-Ⅰ siRNA組（又分為GGTase-Ⅰ siRNA 1組、GGTase-Ⅰ siRNA 2組、GGTase-Ⅰ siRNA 3組），對照組為空白對照組（只加入轉染試劑，不加入siRNA）和陰性對照組（NC-siRNA）。

表 1 針對GGTase-Ⅰ基因序列設計的3條GGTase-Ⅰ siRNATab 1 Three GGTase-Ⅰ siRNA sequences designed for GGTase-Ⅰ gene

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測各組GGTase-Ⅰ、RhoA 的mRNA表達 對轉染48 h的細胞進行總RNA提取，紫外分光光度計測定RNA含量和濃度，取5 μL的總RNA，將RNA反轉錄為cDNA，取1 μL反轉錄產物進行PCR擴增反應，以GAPDH為內參照。GGTase-Ⅰ的上游引物序列：5’-CTCCTGCTGATTTCACTTTGG-3’，下游引物序列：5’-CCACGACAAAGTTGTGGTTCA-3’，產物大小為102 bp；RhoA的上游引物序列：5’-GCTGGACTCGGATTCGTTG-3’，下游引物序列：5’-TGGGAACTGGTCCTTGCTG-3’，產物大小為120 bp。反應條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸31 s，共40個循環。熒光信號實時檢測和數據分析由Stratagene熒光定量PCR儀自動完成，結果采用相對定量法，采用2-??Ct公式計算GGTase-Ⅰ、RhoA mRNA的相對表達水平，其中Ct值為循環閾值。實驗重復3次。

1.2.5 蛋白質免疫印跡法（Western blotting）檢測各組細胞的蛋白表達 提取各組細胞的蛋白質，等量上樣，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）電泳分離，電轉移（轉膜條件：GAPDH、GGTase-Ⅰ，200 mA，90 min；Rho A，200 mA，70 min），5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h后，加入一抗（GAPDH，1︰1 000；GGTase-Ⅰ，1︰200；RhoA，1︰500），4 ℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（triethanolamine buffered saline，TBST）沖洗3次，加入二抗（1︰50 000），37 ℃搖床孵育2 h。TBST沖洗后，電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）檢測，顯色曝光。實驗重復3次。

根據GGTase-Ⅰ蛋白和mRNA表達量選取GGTase-Ⅰ siRNA組中沉默效率最強的一組作為實驗組。檢測實驗組、陰性對照組、空白對照組細胞Cyclin D1、p21蛋白表達，方法同前（轉膜條件：Cyclin D1，200 mA，90 min；p21，200 mA，70 min。一抗濃度：Cyclin D1，1︰500；p21，1︰500）。實驗重復3次。

1.2.6 CCK-8試劑盒檢測Cal-27增殖能力 將細胞每孔2 000個接種于96孔培養板中，待細胞融合約30%時，實驗組、陰性對照組、空白對照組分別轉染siRNA，使siRNA終濃度為50 nmol·L-1。實驗每組設5個復孔。按照試劑盒說明書操作，分別測定轉染0、24、48 h后450 nm波長下各孔吸光度值，比較組間差異。實驗重復3次。

1.2.7 流式細胞儀檢測Cal-27細胞周期 實驗組、陰性對照組、空白對照組分別收集轉染48 h后的6孔板細胞（每組至少6個孔），PBS沖洗3次，用0.25%胰酶消化細胞，用含血清的培養液中止，輕輕吹打，收集細胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，小心吸除上清。按照說明書放入流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料的組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染后各組細胞的mRNA表達

實時熒光定量PCR檢測結果表明，轉染48 h后，與陰性對照組和空白對照組相比，GGTase-Ⅰ siRNA 組Cal-27細胞的GGTase-Ⅰ mRNA表達下降（P＜0.05）；GGTase-Ⅰ siRNA組間相比，GGTase-Ⅰ siRNA 2組的mRNA表達低于GGTase-Ⅰ siRNA 1組和GGTase-Ⅰ siRNA 3組（P＜0.05），表明GGTase-Ⅰ siRNA 2組的干擾效果優于GGTase-Ⅰ siRNA 1組和GGTase-Ⅰ siRNA 3組。各組的RhoA mRNA表達無統計學差異（P＞0.05）（圖1）。

2.2 轉染后各組細胞的GGTase-Ⅰ、RhoA蛋白表達

Western blotting檢測結果表明，轉染48 h后，與陰性對照組和空白對照組相比，GGTase-Ⅰ siRNA組Cal-27細胞的GGTase-Ⅰ蛋白表達下降（P＜0.05）；GGTase-Ⅰ siRNA組間相比，GGTase-Ⅰ siRNA 2組的GGTase-Ⅰ蛋白表達低于GGTase-Ⅰ siRNA 1組和GGTase-Ⅰ siRNA 3組（P＜0.05），表明GGTase-ⅠsiRNA 2組的干擾效果優于GGTase-Ⅰ siRNA 1組和GGTase-Ⅰ siRNA 3組。各組的RhoA 蛋白表達無統計學差異（P＞0.05）（圖2）。

圖 1 轉染48 h后各組的GGTase-Ⅰ、RhoA mRNA表達Fig 1 Expression of GGTase-Ⅰ, RhoA mRNA 48 h after transfection of every group

圖 2 轉染48 h后各組的GGTase-Ⅰ、RhoA蛋白表達Fig 2 Expression of GGTase-Ⅰ, RhoA protein 48 h after transfection of every group

2.3 轉染后各組細胞的Cyclin D1、p21蛋白表達

根據mRNA和Western blotting檢測結果，選取干擾效率最強的GGTase-Ⅰ siRNA 2組作為實驗組。Western blotting檢測結果表明，轉染48 h后實驗組與陰性對照組和空白對照組相比，Cyclin D1蛋白表達下降，p21蛋白表達升高（P＜0.05）（圖3）。

圖 3 轉染48 h后各組Cyclin D1、p21蛋白的表達Fig 3 Expression of Cyclin D1, p21 protein 48 h after transfection of every group

2.4 轉染不同時間各組細胞的增殖變化

轉染0、24、48 h后，空白對照組和陰性對照組之間的細胞增殖能力無明顯差異，而實驗組細胞的增殖能力下降（P＜0.05）（圖4）。

圖 4 轉染不同時間各組細胞的增殖活力Fig 4 Cell proliferation ability with different time after transfection of every group

2.5 轉染后各組細胞周期的變化

流式細胞儀檢測結果（圖5）表明，轉染48 h后，與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組的S期細胞下降，G2期細胞上升（P＜0.05）。

圖 5 轉染48 h后各組的細胞周期變化Fig 5 The effect of cell cycle 48 h after transfection of every group

3 討論

Rho家族蛋白具有GTP酶活性，是目前研究較多的與癌癥相關的基因家族[4]。Rho家族蛋白成員參與了細胞骨架調節、細胞轉錄調控、細胞周期進程、細胞微管運輸等多種與癌癥相關的信號通路的調節[5]。Rho蛋白的羥基端氨基酸序列為CAAX基序，其中“C”為半胱氨酸，“A”為脂肪族氨基酸，“X”代表任意氨基酸。GGTase-Ⅰ由α、β兩個亞基組成，對包括Rho家族蛋白在內的多種GTP酶的CAAX序列進行異戊二烯化，參與GTP酶蛋白的翻譯后修飾，引導酶蛋白正確定位于細胞膜上，是GTP酶被激活的前提[6]。研究[7]證實，GGTase-Ⅰ對癌細胞的增殖、遷移、凋亡以及化療敏感性都有不同程度的影響，抑制GGTase-Ⅰ的活性可抑制腫瘤細胞增殖，從而抑制腫瘤的發展。

本實驗證實GGTase-Ⅰ基因沉默后，RhoA基因的mRNA和蛋白變化無明顯變化，推測GGTase-Ⅰ基因與RhoA的細胞內合成無關；同時，抑制細胞GGTase-Ⅰ基因的表達后，發現細胞的增殖受到抑制，細胞周期發生改變，Cyclin D1表達明顯下降，p21表達明顯上升。

真核細胞的細胞周期分為4個階段：G1期、S期、G2期、M期。G1/S期的過程決定細胞能否進行DNA復制，是細胞增殖的關鍵。腫瘤的發生、發展、侵襲及遠處轉移都與細胞增殖活性密切相關，細胞的增殖失控是惡性腫瘤的典型特點。細胞增殖主要由細胞周期調節因子細胞周期素（Cyclins）和細胞周期依賴性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）等蛋白控制，受多種信號機制調控。Cyclin D1是發現最早的原癌基因[8]，在肝癌[9]、食管癌[10]、腸癌[11]、宮頸癌[12]等多種腫瘤細胞中過度表達，是G1期細胞向S期轉變的關鍵蛋白[13-14]。RhoA、Rac 和Cdc42都能促進Cyclin D1的轉錄，Rac還可參與促進Cyclin D1的mRNA翻譯[15]。本研究結果顯示，沉默GGTase-Ⅰ后，Cyclin D1的表達下降，細胞G1/S期轉變受抑制，S期細胞明顯下降，細胞增殖明顯被抑制，與沉默RhoA后細胞增殖活性下降的研究結果一致[16]。

Rho家族蛋白除上調Cyclin D1外，還可以下調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物（Cyclin-dependent kinase inhibitor protein，CDKI）。有絲分裂抑制因子p21是第一個被發現的CDKIs成員，可被P53誘導生成，抑制DNA復制，阻止CDKs與特異Cyclin結合，包括Cyclin A/CDK2、Cyclin E/CDK2、Cyclin D1/CDK4和Cyclin D2/CDK4等的結合[17-19]，從而抑制細胞G1/S期的轉變，負性調節細胞周期，抑制細胞增殖[20-21]。研究[22-23]證實，上調p21在細胞中的表達，可以抑制DNA復制，抑制腫瘤細胞G1/S期的轉變，從而抑制細胞過度增殖，與腫瘤的治療和預后正相關。使用RhoA抑制劑辛伐他汀可通過抑制RhoA表達，使細胞內p21顯著上調，抑制細胞增殖[24]。此外還有研究[25]證實，GGTase-Ⅰ可能通過調節P53來發揮細胞周期的調控。本研究中，抑制GGTase-Ⅰ后，RhoA的基因和蛋白表達均無明顯變化，而Cyclin D1明顯下降，p21蛋白表達顯著上升，推測GGTase-Ⅰ是在RhoA蛋白修飾過程中發揮了重要作用，未對RhoA基因表達產生抑制，并通過促進Cyclin D1生成、抑制p21表達來影響腫瘤細胞的增殖。

本實驗證實，GGTase-Ⅰ siRNA可以有效地抑制人舌鱗狀細胞癌細胞株Cal-27的GGTase-Ⅰ表達，改變細胞周期，抑制細胞增殖，推測抑制GGTase-Ⅰ表達可以抑制RhoA蛋白的翻譯后修飾從而抑制RhoA蛋白活性，調控Cyclin D1和p21的表達，改變細胞周期，抑制舌癌細胞的增殖，證實了GGTase-Ⅰ可能作為舌鱗狀細胞癌基因治療的靶點，為腫瘤的治療提供新的治療思路，但其在Rho家族蛋白的具體作用機制尚需進一步研究。

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（本文編輯 李彩）

Effects of geranylgeranyltransferaseⅠsilencing on the proliferation of tongue squamous cancer cells

Wang Ying1, Wang Qimin2, Li Jinghua3, Han Jinhong2,4, Wang Lili3, Chao Chen5, Zhou Jianhua2, Tong Lei2, Lu Xufei2,6, Zhou Yuan1, Liao Yixiang2, He Zongxuan2, Li Ning7, Cao Lei7, Liu Wenjun8, Chen Zhenggang2,9.
(1. College of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261021, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China; 3. Central Lab, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China; 4. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Yantai Stomatological Hospital, Yantai 264008, China; 5. Dept. of Surgery, Qingdao Clinical Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Qingdao 266071, China; 6. Dept. of Stomatology, Pudong Hospital of Jimo City, Qingdao 266234, China; 7. Postgraduate School, Dalian Medical University, Dalian 116044, China; 8. Dept. of Otorhinolaryngology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China; 9. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China)

ObjectiveThis study aims to investigate the effect of geranylgeranyltransferaseⅠ (GGTase-Ⅰ) on the proliferation and growth of tongue squamous cancer cells.MethodsThree small interfering RNAs (siRNAs) were designed on the basis of the GGTase-Ⅰ sequence inGeneBank. These siRNAs were then transfected into tongue squamous cancer cells Cal-27. The mRNA and protein expression of GGTase-Ⅰ and RhoA were examined by real-time quantitative polymerase chain reaction and Western blotting, respectively. The expression of Cyclin D1 and p21 were examined by Western blotting. The proliferation and growth ability were analyzed by cell counting kit-8 assay and fow cytometry.ResultsThe mRNA and protein expression of GGTase-Ⅰ in Cal-27 was reduced signifcantly after the GGTase-Ⅰ siRNAs were transfected (P＜0.05). No signifcant difference in RhoA mRNA and protein expression was detected (P＞0.05). Cyclin D1 expression decreased, whereas p21 expression increased signifcantly. The cell cycle was altered, and the growth-proliferative activity was inhibited (P＜0.05).ConclusionGGTase-Ⅰ siRNA can inhibit the expression of GGTase-Ⅰ and the proliferative activity of tongue squamous cancer cells. GGTase-Ⅰ may be a potential target for gene therapy in tongue squamous cell cancer.

geranylgeranyltransferaseⅠ; RhoA; tongue squamous cancer; proliferation; Cyclin D1; p21

R 739.8

A

10.7518/hxkq.2017.04.006

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81372908); Project of Qingdao Municipal Health and Family Planning Commission (2014-WJZD009, 2013-WSZD011). Correspondence: Chen Zhenggang, E-mail: chenzhg1973 @163.com.

2016-10-11；

2017-04-09

國家自然科學基金（81372908）；青島市衛計委計劃項目（2014-WJZD009，2013-WSZD011）

王瑩，碩士，E-mail：469055264@qq.com

陳正崗，副主任醫師，博士，E-mail：chenzhg1973@163. com