不同體積分?jǐn)?shù)氧氣對(duì)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞骨架改建的影響

何曉蘭包廣潔,2孫凌璐張雪保善英康宏

1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，蘭州 730000；

2.西北民族大學(xué)甘肅省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北民族大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030

·基礎(chǔ)研究·

不同體積分?jǐn)?shù)氧氣對(duì)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞骨架改建的影響

何曉蘭1包廣潔1,2孫凌璐1張雪1保善英1康宏1

1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，蘭州 730000；

2.西北民族大學(xué)甘肅省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北民族大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030

目的探討不同體積分?jǐn)?shù)的氧氣對(duì)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞3種細(xì)胞骨架蛋白改建的影響。方法體外分離、培養(yǎng)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞，傳代至第2代，分別于常氧21%O2及低氧8%O2、4%O2、2%O2下培養(yǎng)。甲苯胺藍(lán)、天狼星紅及Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察不同氧體積分?jǐn)?shù)下細(xì)胞顯型的變化。細(xì)胞免疫熒光染色和實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白，包括肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和波形蛋白的表達(dá)情況。。結(jié)果不同氧體積分?jǐn)?shù)下關(guān)節(jié)盤細(xì)胞仍然具有成纖維特性，3種細(xì)胞骨架蛋白有規(guī)律地排列。4%O2時(shí)，肌動(dòng)蛋白和波形蛋白熒光強(qiáng)度最低（P＜0.05）；2%O2時(shí)，微管蛋白熒光強(qiáng)度最高（P＜0.05），其他各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。檢測(cè)肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)，21%O2組最高，而2%O2組和4%O2組最低（P＜0.05）；微管蛋白mRNA表達(dá)在2%O2組最高，8%O2組最低（P＜0.05）；波形蛋白mRNA表達(dá)，在4%O2組最低，21%O2組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論在不同氧體積分?jǐn)?shù)條件下，細(xì)胞骨架蛋白有不同程度的改建，2%O2可能是適合顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞擴(kuò)增的最佳氧體積分?jǐn)?shù)。

顳下頜關(guān)節(jié)盤； 低氧； 細(xì)胞骨架； 肌動(dòng)蛋白； 微管蛋白； 波形蛋白

顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）的關(guān)節(jié)盤是位于下頜骨髁突和顳骨關(guān)節(jié)窩之間橢圓形的，質(zhì)地致密且無(wú)血管的纖維軟骨組織[1-3]，其正常代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氧和葡萄糖等，主要依靠關(guān)節(jié)滑液和連接到雙板區(qū)血管的擴(kuò)散完成[4]，因此關(guān)節(jié)盤被認(rèn)為是處于生理性低氧環(huán)境中的組織[5]。

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（temporomandibular joint disorders，TMD）具有患病率高、慢性遷延、影響面廣的特征[6]。無(wú)支架的自組裝技術(shù)在修復(fù)TMD導(dǎo)致的關(guān)節(jié)盤缺損或替換受損的關(guān)節(jié)盤等方面有較好的應(yīng)用前景[7]，但是選擇合適的種子細(xì)胞仍是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題[8]。細(xì)胞骨架是位于細(xì)胞膜下面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，反映著細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[9]。Lee等[10]在對(duì)自組裝機(jī)制的研究中指出，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的主動(dòng)收縮是自組裝過(guò)程中必不可少的因素，有效的軟骨細(xì)胞自組裝需要完整的細(xì)胞骨架。本研究假設(shè)：控制TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞生長(zhǎng)的氧環(huán)境可以改變細(xì)胞骨架及其骨架的反應(yīng)性，從而為TMJ關(guān)節(jié)盤組織工程種子細(xì)胞優(yōu)化選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

Ⅰ型膠原、微管蛋白、波形蛋白單克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）；Ⅰ型膠原酶、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-鬼筆環(huán)肽（Sigma公司，美國(guó)）；FITC-抗鼠IgG和羅丹明-抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 關(guān)節(jié)盤細(xì)胞分離與培養(yǎng)

自屠宰廠購(gòu)買宰殺2 h內(nèi)的1月齡山羊頭，清洗干凈，75%乙醇浸泡30 min。無(wú)菌條件下取出雙側(cè)TMJ關(guān)節(jié)盤，修剪凈周圍組織，PBS充分沖洗后將其剪碎至約1 mm3大小，置于0.2%Ⅰ型膠原酶溶液中，于37 ℃、90 r·min-1恒溫水浴搖床上消化過(guò)夜，約16 h。次日，DMEM/F-12洗3次，收集細(xì)胞。用含10%胎牛血清、25 μg·mL-1維生素C和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2及21%O2飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，傳代，取第二代細(xì)胞（P2）用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及不同體積分?jǐn)?shù)氧干預(yù)

實(shí)驗(yàn)分4組：常氧21%O2組，低氧8%O2組、4%O2組、2%O2組。生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P2代關(guān)節(jié)盤細(xì)胞以每毫升1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿和預(yù)先放置蓋玻片的12孔板中，分別置于二氧化碳培養(yǎng)箱（21%O2）及氧體積分?jǐn)?shù)為2%O2、4%O2、8%O2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，三氣培養(yǎng)箱中充入N2，以獲得需要的氧體積分?jǐn)?shù)。4～5 d后，細(xì)胞融合至85%左右，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（realtime reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR），檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、波形蛋白mRNA的表達(dá)；同時(shí)固定細(xì)胞爬片，分別行甲苯胺藍(lán)、天狼星紅和Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色以鑒定不同體積分?jǐn)?shù)氧含量下的關(guān)節(jié)盤細(xì)胞，然后行細(xì)胞免疫熒光染色，觀察3種細(xì)胞骨架蛋白（肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、波形蛋白）的表達(dá)情況。

1.4 顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞的鑒定

甲苯胺藍(lán)染色：滴加甲苯胺藍(lán)染液于細(xì)胞爬片上，染色30 min。天狼星紅染色：滴加天狼星紅染液于細(xì)胞爬片上染色1 h，PBS洗，蘇木素復(fù)染1 min。Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色：按免疫組織化學(xué)試劑盒SP法進(jìn)行。染色完成后，經(jīng)蒸餾水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.5 細(xì)胞骨架蛋白免疫熒光染色及熒光強(qiáng)度分析

經(jīng)過(guò)固定的細(xì)胞爬片，用含0.1% Triton X-100 的PBS通透5 min，PBS洗，含2%BSA、0.1% Tween 20的PBS封閉1 h。肌動(dòng)蛋白染色：滴加1∶60稀釋的FITC-鬼筆環(huán)肽室溫避光孵育60 min。微管蛋白和波形蛋白染色：分別滴加1∶200稀釋的微管蛋白和波形蛋白一抗，4 ℃過(guò)夜孵育，次日分別滴加1∶200稀釋二抗羅丹明-抗兔IgG和FITC-抗鼠IgG抗體。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1）染核2 min，PBS洗，抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察，采集熒光圖像。Image-Pro Plus 6.0軟件分析骨架蛋白的熒光強(qiáng)度，每張圖像隨機(jī)選取10個(gè)細(xì)胞，每個(gè)骨架蛋白共分析40個(gè)細(xì)胞。

1.6 RT-qPCR

RT-qPCR檢測(cè)肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、波形蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量。按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說(shuō)明步驟提取細(xì)胞總RNA，第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。細(xì)胞相關(guān)基因引物由上海生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參基因，相關(guān)基因序列見表1。采用2-（??Ct）法對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析比較。

表 1 RT-qPCR引物Tab 1 Primers for RT-qPCR

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞的鑒定

圖 1 TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 光鏡 × 400Fig 1 Morphology of TMJ disc cells optical microscope × 400

光鏡下，常氧21%O2組細(xì)胞多呈多邊形，低氧8%O2、4%O2、2%O2組細(xì)胞以長(zhǎng)梭形為主（圖1A1—A4）。各種不同氧體積分?jǐn)?shù)下，甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色（圖1B1—B4），表明關(guān)節(jié)盤細(xì)胞有糖胺多糖產(chǎn)生；天狼星紅染色可見，細(xì)胞質(zhì)呈紫紅色（圖1C1—C4），表明關(guān)節(jié)盤細(xì)胞有膠原產(chǎn)生；Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒（圖1D1—D4），表明Ⅰ型膠原染色陽(yáng)性。細(xì)胞鑒定結(jié)果表明，不同氧體積分?jǐn)?shù)下關(guān)節(jié)盤細(xì)胞仍具有成纖維特性。

2.2 細(xì)胞骨架蛋白免疫熒光染色及熒光強(qiáng)度值分析

圖 2 TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞骨架蛋白的變化 免疫熒光染色 × 400Fig 2 Cytoskeleton of TMJ disc cells immunofuorescence staining × 400

不同氧體積分?jǐn)?shù)下3種細(xì)胞骨架蛋白有規(guī)律地排列，但是各組間的熒光強(qiáng)度有差異。關(guān)節(jié)盤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白微絲沿細(xì)胞膜外圍均勻排列，與細(xì)胞長(zhǎng)軸方向一致（圖2A1—A4）；熒光強(qiáng)度分析可見，4%O2組肌動(dòng)蛋白熒光強(qiáng)度最低（P＜0.05），其他3組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3左）。微管蛋白從細(xì)胞核伸展到細(xì)胞膜邊緣，逐漸松散成網(wǎng)狀（圖2B1—B4）；熒光強(qiáng)度分析顯示，2%O2組微管蛋白熒光強(qiáng)度最高（P＜0.05）（圖3中）。波形蛋白細(xì)胞核周熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，向細(xì)胞膜周圍逐漸減弱（圖2C1—C4）；熒光強(qiáng)度分析顯示，4%O2組波形蛋白熒光強(qiáng)度最低（P＜0.05），其他3組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3右）。

圖 3 TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞骨架蛋白免疫熒光染色的熒光強(qiáng)度分析Fig 3 Immunofuorescence staining intensity analysis of TMJ disc cells cytoskeleton

2.3 細(xì)胞骨架蛋白mRNA表達(dá)的變化

不同氧體積分?jǐn)?shù)下3種細(xì)胞骨架蛋白mRNA表達(dá)變化見表2。肌動(dòng)蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量，在2%O2和4%O2組最低，21%O2組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。微管蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量，在2%O2組最高，8%O2組最低（P＜0.05）。波形蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量，在4%O2組最低，21%O2組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表 2 TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞3種骨架蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab 2 Cytoskeleton mRNA relative expression levels of TMJ disc cells

3 討論

TMJ關(guān)節(jié)盤是無(wú)血管的組織，Kuo等[11]通過(guò)對(duì)豬TMJ關(guān)節(jié)盤不同分區(qū)細(xì)胞密度和基礎(chǔ)耗氧率的研究，指出關(guān)節(jié)盤可能存在一個(gè)比關(guān)節(jié)軟骨更高的氧梯度，Cisewski等[12]對(duì)關(guān)節(jié)盤細(xì)胞代謝的研究也提出這一觀點(diǎn)。研究[13]證實(shí)，關(guān)節(jié)軟骨從表層到深層有一個(gè)6%至1%的氧體積分?jǐn)?shù)梯度，在病理情況下這一氧體積分?jǐn)?shù)更低。考慮TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞處于低氧的生理環(huán)境中，本研究嘗試通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫熒光染色和RT-qPCR等方法，探討不同的氧體積分?jǐn)?shù)下TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白，包括肌動(dòng)蛋白、微管蛋白及波形蛋白的組織結(jié)構(gòu)以及mRNA的表達(dá)。

細(xì)胞骨架是存在于真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，主要由微絲、微管及中間絲組成，在維持細(xì)胞生物力學(xué)功能上發(fā)揮重要作用[14-16]。微絲由肌動(dòng)蛋白單體聚合合成，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架被視為調(diào)控細(xì)胞形態(tài)和產(chǎn)生細(xì)胞生物力的關(guān)鍵因素，在細(xì)胞生理和病理行為中起重要作用[17]。研究[18]表明，TMJ關(guān)節(jié)盤中肌動(dòng)蛋白表達(dá)上調(diào)是退行性變的跡象，細(xì)胞表現(xiàn)為收縮的表型，可能參與關(guān)節(jié)盤組織的收縮和修復(fù)。微管是高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞骨架成分，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞分裂[19]。微管的主要成分微管蛋白對(duì)軟骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)有重要影響，微管蛋白破壞可致軟骨細(xì)胞早期凋亡[20]。波形蛋白是中間纖維的一種蛋白，在所有TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞中均有表達(dá)[18]。研究[21]顯示，波形蛋白可能是TMJ內(nèi)紊亂和滑膜病理性肥大的重要標(biāo)志。

過(guò)去關(guān)于細(xì)胞骨架的研究[22-25]多與生物力學(xué)有關(guān)，低氧條件下細(xì)胞骨架的重構(gòu)或改建很少被研究。本研究結(jié)果顯示，不同氧體積分?jǐn)?shù)下3種細(xì)胞骨架蛋白有規(guī)律排列，但熒光強(qiáng)度和相關(guān)基因表達(dá)有差異。2%O2及4%O2下，肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)下調(diào)，可能由于低氧環(huán)境部分逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞的表型，向著正常的關(guān)節(jié)盤細(xì)胞分化；微管蛋白mRNA在2%O2下表達(dá)最高，可能與細(xì)胞的分裂活動(dòng)有關(guān)，在2%O2下細(xì)胞表現(xiàn)為更高的活性和分裂能力；4%O2下，波形蛋白mRNA表達(dá)降低，而其他3組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本課題組前期的研究[26]結(jié)果提示，TMJ關(guān)節(jié)盤自組裝基體在培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)收縮變小的現(xiàn)象可能與肌動(dòng)蛋白的過(guò)表達(dá)有關(guān)，且TMJ細(xì)胞隨傳代次數(shù)的增加肌動(dòng)蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)。結(jié)合本次研究，筆者推測(cè)，體積分?jǐn)?shù)2%O2可能最適合關(guān)節(jié)盤細(xì)胞擴(kuò)增。低氧可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架的改建，具體表現(xiàn)在2%O2時(shí)，肌動(dòng)蛋白熒光強(qiáng)度減弱，微管蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)下調(diào)，微管蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)。這一改變是否與細(xì)胞活性和細(xì)胞表型改變相關(guān)還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步的研究。

[1] Stankovi? S, Vlajkovi? S, Bo?kovi? M, et al. Morphological and biomechanical features of the temporomandibular joint disc: an overview of recent fndings[J]. Arch Oral Biol, 2013, 58(10):1475-1482.

[2] Piette E. Anatomy of the human temporomandibular joint. An updated comprehensive review[J]. Acta Stomatol Belg, 1993, 90(2):103-127.

[3] Benjamin M, Ralphs JR. Biology of fbrocartilage cells[J]. Int Rev Cytol, 2004, 233:1-45.

[4] Alonso LG, Smith RL, Junior JAF, et al. Ultrastructural evidence of vascularization of the central zone of the temporomandibular joint disc in human fetus[J]. Eur J Anat, 2016, 10(2):45-48.

[5] Yamaguchi A, Tojyo I, Yoshida H, et al. Role of hypoxia and interleukin-1beta in gene expressions of matrix metalloproteinases in temporomandibular joint disc cells[J]. Arch Oral Biol, 2005, 50(1):81-87.

[6] Chisnoiu AM, Picos AM, Popa S, et al. Factors involved in the etiology of temporomandibular disorders—a literature review[J]. Clujul Med, 2015, 88(4):473-478.

[7] DuRaine GD, Brown WE, Hu JC, et al. Emergence of scaffoldfree approaches for tissue engineering musculoskeletal cartilages[J]. Ann Biomed Eng, 2015, 43(3):543-554.

[8] Shu W, Liu L, Bao G, et al. Tissue engineering of the temporomandibular joint disc: current status and future trends [J]. Int J Artif Organs, 2015, 38(2):55-68.

[9] Hsieh CH, Lin YH, Lin S, et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy[J]. Osteoarthr Cartil, 2008, 16(4): 480-488.

[10] Lee JK, Hu JC, Yamada S, et al. Initiation of chondrocyte self-assembly requires an intact cytoskeletal network[J]. Tissue Eng Part A, 2016, 22(3/4):318-325.

[11] Kuo J, Shi C, Cisewski S, et al. Regional cell density distribution and oxygen consumption rates in porcine TMJ discs: an explant study[J]. Osteoarthr Cartil, 2011, 19(7):911-918.

[12] Cisewski SE, Zhang L, Kuo J, et al. The effects of oxygen level and glucose concentration on the metabolism of porcine TMJ disc cells[J]. Osteoarthr Cartil, 2015, 23(10):1790-1796.

[13] Cernanec J, Guilak F, Weinberg JB, et al. Infuence of hypoxia and reoxygenation on cytokine-induced production of proinfammatory mediators in articular cartilage[J]. Arthritis Rheum, 2002, 46(4):968-975.

[14] Blain EJ. Involvement of the cytoskeletal elements in articular cartilage homeostasis and pathology[J]. Int J Exp Pathol, 2009, 90(1):1-15.

[15] Benjamin M, Archer CW, Ralphs JR. Cytoskeleton of cartilage cells[J]. Microsc Res Tech, 1994, 28(5):372-377.

[16] Chen C, Yin L, Song X, et al. Effects of vimentin disruption on the mechanoresponses of articular chondrocyte[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 469(1):132-137.

[17] Jin H, Liang Q, Chen T, et al. Resveratrol protects chondrocytes from apoptosis via altering the ultrastructural and biomechanical properties: an AFM study[J]. PLoS ONE, 2014, 9(3):e91611.

[18] Leonardi R, Villari L, Piacentini C, et al. Immunolocalization of vimentin and alpha-smooth muscle actin in dysfunctional human temporomandibular joint disc samples[J]. J Oral Rehabil, 2002, 29(3):282-286.

[19] Thyberg J, Moskalewski S. Role of microtubules in the organization of the Golgi complex[J]. Exp Cell Res, 1999, 246 (2):263-279.

[20] 郭恒, 段王平, 李琦, 等. 微管蛋白破壞對(duì)軟骨細(xì)胞代謝功能的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 91(15):1036-1040.

Guo H, Duan WP, Li Q, et al. Disassembly of the tubulin cytoskeleton disrupts articular cartilage chondrocyte homeostasis[J]. Natl Med J China, 2011, 91(15):1036-1040.

[21] Yoshida H, Fukumura Y, Nishida M, et al. The immunohistochemical distribution of vimentin in human temporomandibular joint samples[J]. J Oral Rehabil, 2004, 31(1):47-51.

[22] Trickey WR, Vail TP, Guilak F. The role of the cytoskeleton in the viscoelastic properties of human articular chondrocytes [J]. J Orthop Res, 2004, 22(1):131-139.

[23] Noriega S, Hasanova G, Subramanian A. The effect of ultrasound stimulation on the cytoskeletal organization of chondrocytes seeded in three-dimensional matrices[J]. Cells Tissues Organs, 2013, 197(1):14-26.

[24] Pascarelli NA, Collodel G, Moretti E, et al. Changes in ultrastructure and cytoskeletal aspects of human normal and osteoarthritic chondrocytes exposed to interleukin-1β and cyclical hydrostatic pressure[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(11): 26019-26034.

[25] Magara J, Nozawa-Inoue K, Suzuki A, et al. Alterations in intermediate flaments expression in disc cells from the rat temporomandibular joint following exposure to continuous compressive force[J]. J Anat, 2012, 220(6):612-621.

[26] 孔楠楠, 張文霞, 康宏, 等. 山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的研究[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究, 2015, 31(10):953-956.

Kong NN, Zhang WX, Kang H, et al. Study on the cytoskeleton of cultured goat temporomandibular joint disc cells[J]. J Oral Sci Res, 2015, 31(10):953-956.

（本文編輯 吳愛華）

Effect of different oxygen tension on the cytoskeleton remodeling of goat temporomandibular joint disc cells

He Xiao-lan1, Bao Guangjie1,2, Sun Linglu1, Zhang Xue1, Bao Shanying1, Kang Hong1.
(1. Institute of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Oral Diseases of Gansu Provincial, Key Laboratory of Stomatology of State Ethnic Affairs Commission, Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China)

ObjectiveThe effect of different oxygen tensions on the cytoskeleton remodeling of goat temporomandibular joint (TMJ) disc cells were investigated.MethodsGoat TMJ disc cells were cultured under normoxia (21% O2) and hypoxia (2%, 4%, and 8% O2). Toluidine blue, picrosirius red, and type Ⅰ collagen immunocytochemical staining were performed to observe the changes in cell phenotype under different oxygen levels. Immunofuorescent staining and real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis were then performed to identify actin, tubulin, and vimentin in the cultured disc cells.ResultsTMJ disc cells still displayed fbroblast characteristics under different oxygen levels and their cytoskeletons had regular arrangement. The fuorescence intensities of actin and vimentin were lowest at 4% O2(P＜0.05), whereas that of tubulin was highest at 2% O2(P＜0.05). No signifcant difference among the other groups was observed (P＞0.05). Actin mRNA levels were considerably decreased at 2% O2and 4% O2in hypoxic conditions, while actin mRNA expression was highest in 21% O2. Tubulin mRNA levels considerably increased at 2% O2, while tubulin mRNA expression was lowest in 8% O2(P＜0.05). Vimentin mRNA expression was lowest at 4% O2and highest at 21% O2, and signifcant differences were observed between vimentin mRNA expression levels among these oxygen levels (P＜0.05).ConclusionCytoskeletons were recon-structed in different oxygen tensions, and 2% O2may be the optimal oxygen level required to proliferate TMJ disc cells.

temporomandibular joint disc; hypoxia; cytoskeleton; actin; tubulin; vimentin

R 78

A

10.7518/hxkq.2017.04.004

Supported by: Natural Nation Science Foundation of China (81160139, 81660189). Correspondence: Kang Hong, E-mail: kanghong@lzu.edu.cn.

2017-01-11；

2017-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金（81160139，81660189）

何曉蘭，碩士，E-mail：hexl2014@lzu.edu.cn

康宏，教授，博士，E-mail：kanghong@lzu.edu.cn