結核分枝桿菌rBCG-Rv2029c重組疫苗的構建與鑒定

薛士鵬，吳建勇,宋 彬，齊紅雙，李 英，黨潁徐，滿永宏

結核分枝桿菌rBCG-Rv2029c重組疫苗的構建與鑒定

薛士鵬1，吳建勇1,宋 彬1，齊紅雙2，李 英2，黨潁徐2，滿永宏1

目的構建結核分枝桿菌rBCG-Rv2029c重組疫苗并鑒定。方法通過PCR擴增Rv2029c抗原編碼基因，然后用雙酶切法將Rv2029c和pMV261質粒酶切，再將酶切產物連接成rpMV261-2029c重組質粒，用電穿孔法將該質粒導入BCG中構建成rBCG-Rv2029c重組疫苗，最后用SDS-PAGE和Western blotting鑒定表達的重組蛋白。結果通過PCR成功擴增出1 020 bp的Rv2029c基因，插入到pMV261質粒中，再把融合基因成功導入BCG中，經雙酶切及基因比對鑒定證實，再通過熱誘導后用Western blotting顯示重組蛋白具有免疫原性。結論成功構建了結核分枝桿菌rBCG-Rv2029c重組活疫苗，為重組疫苗的免疫機制研究奠定基礎。

卡介苗；重組疫苗；結核桿菌；Rv2029c

BCG(卡介苗)的免疫保護功能對兒童較理想，但其遠期的免疫效果并不理想，在各類人群中的免疫保護作用不等[1]。其主要原因是MTB(結核分枝桿菌)感染為休眠感染及BCG中的基因丟失、突變，并且環境中分枝桿菌和MTB存在交叉抗原，從而影響了BCG接種效果[2]。所以各國學者近幾年來，正致力于新型結核病疫苗的研究，如改良病毒疫苗[3]、DNA疫苗[4]、蛋白疫苗[5]、MTB減毒活疫苗[6]。

有研究發現，Rv2029c蛋白能在結核病病人和潛伏感染者中誘導特異性免疫應答，尤其在潛伏感染者中，其誘導的免疫反應遠超過結核病病人，Rv2029c蛋白能起到較好的免疫刺激作用[7]，且Rv2029c重組蛋白在人T細胞中也可刺激產生明顯的免疫反應，同時，在感染MTB的人體中，Rv2029c具有顯著的免疫原性[8]。所以本次實驗擬將Rv2029c作為目的基因構建重組DNA疫苗，為新型結核病疫苗的免疫機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒 從結核分枝桿菌H37Rv分離的基因組DNA，以及含有大腸埃希菌-分枝桿菌穿梭表達質粒pMV261的大腸埃希菌菌液均由本實驗室保存；BCG上海株(BCG-China strain)：購于中國生物制品檢定所，由南陽醫學高等專科學校研究中心實驗室常規培養并凍存。

1.2 實驗試劑 用于質粒重組的限制性核酸內切酶BamH I和EcoR I、 TaqDNA聚合酶、dNTP、 DNA連接試劑盒、PCR清潔回收試劑盒、基因組提取試劑盒、膠回收純化試劑盒、質粒提取試劑盒：購于大連寶生物科技有限公司；N-N`-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、Marker、TB-PPD：購于上海生物工程有限公司；結核病人血清：河南省南陽市第六人民醫院提供；羊抗人抗體為Life Technologies(Invitrogen)公司產品。

1.3 重組基因的構建

1.3.1 Rv2029c基因的擴增 根據GenBank中報道的結核分枝桿菌Rv2029c基因序列，并結合質粒pMV261酶切位點設計-對引物即：P1: 5′-TA GGATCC TAC TGC CTC GGT CGC CGC A-3′；P2:5′-AT GAATTC TCA TGG CGA GGC TTC CGG GT-3′以結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，P1、P2為引物進行PCR擴增。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.2 rpMV261-2029c重組質粒的構建 用質粒提取試劑盒按操作步驟提取含有pMV261質粒的大腸埃希菌菌液。將目的基因和空質粒同時進行BamH I和EcoR I雙酶切，將酶切產物加入連接液中 16 ℃過夜。將連接產物轉化入DH5α大腸埃希菌感受態細胞中，然后挑取pMV261的卡拉霉素陽性質粒菌接種至LA(胰化蛋白胨:10 g;酵母提取物:5 g;氯化鈉：10 g；瓊脂粉：3 g；水：1 L)培養基上培養。如果轉化的大腸埃希菌能在LA培養基上生長，則可初步判定質粒轉化成功。再增菌培養，重提質粒，以重組質粒為模板，P1、P2為引物進行PCR擴增并用BamH I和EcoR I進行雙酶切鑒定。將初步鑒定正確的菌液送上海生物公司測序。

1.4 重組卡介苗rBCG-Rv2029c的構建

1.4.1 BCG感受態細胞的制備[9]將BCG菌苗加入細菌培養瓶中，常規培養約4～6 周，當菌膜鋪滿培養基表面，即可制備感受態細胞。加入甘氨酸使其終濃度為5%，繼續培養24 h，向培養瓶中加入高壓滅菌玻璃珠，置于搖床上充分震蕩培養，直至菌膜被打碎成單菌。50 mL離心管收集菌體，用10%超純水稀釋的甘油洗滌，以去除培養基中的離子和其它雜質，連續洗滌3次，最后再用10%甘油重懸BCG，即制成BCG感受態細胞。

1.4.2 重組質粒的電轉化導入 取400 μL BCG感受態細胞懸液加入電穿孔杯中，再加入20 μL重組質粒rpMV261-2029c或pMV261空載體，輕輕混勻后，冰上放置30 min，即進行電轉化。電轉化條件設置為：電阻720 Ω，電壓1.8 kv～2.2 kv(可調)，其它參數自動調節，放電2～3次，2次放電間隔為2 min，以確保菌液溫度不至于過高或BCG細胞破壞，3次放電結束后，置冰浴30 min，而后，將菌懸液加入含有20 μg/mL卡那霉素的Sauton 培養基中，37 ℃恒溫孵箱培養。

1.5 重組卡介苗rBCG-Rv2029c的鑒定

1.5.1 卡拉霉素抗生素篩選 將上述電擊轉化后菌液經37 ℃靜置培養后，若能夠生長，說明該重組BCG卡介苗表達卡拉霉素抗性基因，由于pMV261上含有卡拉霉素抗性基因，則間接說明重組質粒已通過電轉化成功導入卡介苗基因組，此重組卡介苗可進行如下鑒定。

1.5.2 重組卡介苗基因組DNA的提取、PCR鑒定及測序鑒定 擴增菌量，采集菌液重提重組卡介苗基因組，以重組卡介苗基因組為模板，以P1、P2為引物進行PCR擴增，凝膠成像分析系統對PCR產物進行分析，如有明顯的擴增條帶，則可初步判定該重組質粒已成功通過電轉化導入BCG基因組。將PCR擴增鑒定陽性的重組卡介苗基因組保存，并送測序公司進行測序鑒定，測序結果在NCBI中進行blast比對。

1.5.3 重組蛋白的熱誘導表達[10]和western-blot鑒定 取經鑒定后的陽性的重組卡介苗菌苗，從37 ℃的培養環境中迅速移入45 ℃的水浴中，使其處于熱應激環境，作用30 min后將其取出。收集單菌菌液于PBS中，在冰浴下進行超聲破菌。用PEG6000對破碎后的菌液進行濃縮，濃縮至原體積1/50左右即可。收集破菌上清及沉淀、細菌培養基進行SDS-PAGE電泳分析表達產物。然后，取目的膠帶用半干轉移系統將蛋白質轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原1 h，TBST(TBS液中加入終濃度為0.5%的Tween80分散劑)緩沖液洗滌5 min×3次，加入結核病病人血清(1∶100稀釋)，4 ℃過夜，次日復溫至室溫后再放置1 h，TBST洗滌5 min×3次，加入熒光標記的IgG二抗，室溫孵育1 h后，DAB顯色。

2 結 果

2.1 目的基因Rv2029c的PCR獲取 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析顯示，在約1 020 bp處可見特異性擴增條帶，與目的基因Rv2029c大小一致(如圖1示)

M:M2000；1. Rv2029c基因M：DNA Marker D2000; 1. PCR product of rv2029c gene圖1 目的基因Rv2029c的PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳 Fig.1 Agarose electrophoresis for PCR product of rv2029c

2.2 重組穿梭質粒的鑒定

2.2.1 重組質粒rpMV261-Rv2029c的抗生素篩選 將目的基因Rv2029及空質粒pMV261經雙酶切后過夜連接，而后將鏈接子轉化大腸埃希菌感受態細胞E.coliDH5a，結果在含卡那霉素的LB(胰化蛋白胨10 g;酵母提取物5 g;氯化鈉10 g；水1 L)固體培養板上篩選得到數株重組菌落。挑取單菌落在含有卡那霉素的LB液體培養基中仍可增量，說明重組菌落可表達卡拉霉素抗性基因，初步判定重組質粒構建成功。

2.2.2 重組質粒的PCR擴增鑒定 以重組質粒rpMV361-Rv2029c為模板，P1、P2為引物進行PCR擴增鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在約1 020 bp處可見明顯電泳條帶，其大小與Rv2029c基因大小相符(圖2-1泳道)。提取上述3種鑒定均為陽性的重組質粒，送Invitrogen公司測序，通過在NCBI中進行blast比對后，提示目的基因Rv2029c與GenBank中收錄的一致，未發生突變、錯配、缺失等。

1. Rv2029c基因擴增產物；2. 重組質粒rpMV261-Rv2029c；3.BamH I和EcoR I對重組質粒rpMV261-Rv2029c進行雙酶切，在1 020 bp處可見特異性酶切產物；4. BamH I和EcoR I對pMV261空質粒進行雙酶切，未見酶切產物；M：DNA marker IV1: PCR product of rv2029c gene; 2: rpMV261-Rv2029c; 3：rpMV261-Rv2029/BamH I+EcoR I; 4： pMV261/BamH I+EcoR I; M: DNA Marker IV圖2 重組質粒rpMV261-Rv2029c的雙酶切鑒定Fig.2 PCR and restriction digestion of recombinant plasmid rpMV261-Rv2029c DNA Marker IV

2.2.3 重組質粒的酶切鑒定和測序鑒定 將重組質粒命名為rpMV261-Rv2029c，提取經抗生素篩選的陽性重組質粒，用限制性核酸內切酶BamH I和EcoR I對重組質粒進行雙酶切，凝膠電泳顯示，分別在4 500 bp和1 020 bp處可見清晰的電泳條帶(圖2)，分別與pMV261空質粒載體和目的基因Rv2029c大小相符。

3.3 重組疫苗rBCG-R的鑒定

3.3.1 重組疫苗的抗生素篩選 將電轉化后的菌液在含有卡那霉素的Sauton(蘇通瓊脂培養基)培養基中培養，8周后可見少量菌落在培養基表面長出，12周后重組菌體則可鋪滿培養基表面。將菌體轉種后，經4周的培養，菌膜則可鋪滿整個培養基表面，呈侵襲性生長。

3.3.2 重組疫苗基因組DNA的PCR擴增鑒定和測序鑒定 將鑒定陽性的重組菌增菌培養，提取其基因組DNA并以此為模板，以P1、P2為引物進行PCR擴增鑒定，結果如圖3顯示：凝膠電泳在1 020 bp處可見明顯擴增條帶，與Rv2029c基因大小相符。而以rBCG-261和BCG基因組DNA為模板，相同條件下擴增則無特異性條帶。提取經鑒定均為陽性的重組菌體基因組DNA送測序，結果通過NCBI進行blast比對后，顯示目的基因未發生突變、缺失、錯配等。

1．rBCG-R基因組DNA；2. 以rBCG-R基因組DNA為模板進行PCR擴增條帶； M：Marker1. Genomic DNA of rBCG-R; 2. PCR amplification was performed using rBCG-R genomic DNA as template 圖3 重組卡介苗rBCG-R的基因組提取及PCR鑒定Fig.3 PCR and restriction digestion of recombinant plasmid rBCG-R

3.3.3 目的蛋白在重組疫苗rBCG-R中的熱誘導表達和Western-blot鑒定 重組卡介苗經過熱誘導后表達目的蛋白，然后將目的蛋白經SDS-PAGE電泳分析，最后進行Western-blot檢測。結果顯示，DAB顯色后在相對分子量約35 KD處出現了一條特異性反應條帶，在菌體培養液和破菌上清中均可檢出重組蛋白，如圖4。

圖4 重組蛋白的West-blot鑒定Fig.4 Recombinant protein identified by Western blot

3 討 論

由于目前1/3以上的MTB感染以休眠菌的形式存活于體內，一種理想的TB疫苗不僅能誘導機體產生針對活動性MTB的免疫反應，還要求結核菌疫苗能有效提供針對休眠MTB的免疫保護，從而達到增強機體對結核桿菌免疫保護的能力。

MTB休眠存活調節子系統為DosR[11](Dormancy survival regulon),該系統包含近50個基因，其表達產物與MTB休眠密切相關。研究發現，當MTB處于營養素缺乏、缺氧及酸性微環境等應激條件下，Rv2029c呈持續高表達狀態，提示Rv2029c在MTB休眠中發揮關鍵作用[12]。

所以，本研究以MTB休眠相關基因Rv2029c為目的基因[12]構建重組卡介苗新型結核病疫苗rBCG-Rv2029c，主要目的是使該疫苗具有針對休眠MTB的免疫保護能力。此外，我們以BCG為基礎構建重組卡介苗，BCG中含有眾多活動性MTB表達抗原，使rBCG-Rv2029c既具備誘導針對活動性MTB免疫應答的能力，同時，由于重組蛋白為休眠相關抗原Rv2029c，使rBCG-Rv2029c又具備誘導產生針對休眠MTB的免疫反應。

另外，rBCG是活疫苗，接種體內后能自我繁殖，可持續表達其自身蛋白和重組蛋白，不斷刺激免疫系統產生持續的免疫應答。該應答不僅針對BCG表達的眾多免疫顯性抗原，更重要的是其表達的重組蛋白可誘導產生特異性的免疫反應，如針對MTB休眠顯性抗原的免疫應答，通過該方式，可顯著提高重組疫苗的免疫預防效果。同時，rBCG疫苗具備保存條件不高(4°C冷藏即可)、適合大量生產、培養條件簡單、獲取容易、價格低廉[13-16]等有利條件。并且，rBCG疫苗構建的基礎是BCG，具有較高的安全性[17]。

本次實驗把MTB休眠相關基因Rv2029c成功的轉化入了BCG活疫苗中，通過抗生素初篩及基因的比對，Rv2029c沒有發現有錯配，缺失等，并且在熱誘導的條件下能夠表達休眠相關蛋白，只不過表達的量及進入機體后能否表達尚有待進一步研究，為該類新型疫苗的免疫性及安全性評價奠定基礎。

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Man Yong-hong, Email: man-yh@foxmail.com

ConstructionandidentificationofrecombinantrBCG-Rv2029cvaccineofMycobacteriumtuberculosis

XUE Shi-peng1，WU Jian-yong1，SONG Bin1，QI Hong-shuang2, LI Ying2,DAGN Ying-xu2，MAN Yong-hong1

(1.DepartmentofBasicMedical,NanyangMedicalCollege,Nanyang473061,China; 2.NanshiHospitalAffiliatedtoHenanUniversity,Nanyang473006,China)

We constructed a recombinant vaccine ofMycobacteriumtuberculosisrBCG-Rv2029c, and then identified it. Rv2029c antigen encoding gene was amplified by PCR. The enzyme digestion products were ligated into rpMV261-2029c recombinant plasmid,after double digestion of Rv2029c and pmv261 vector, and then we introduced the plasmid into BCG to construct rBCG-Rv2029c recombinant vaccine by electroporation method. Finally, we analyzed the expression of the recombinant protein by SDS-PAGE and Western blotting. A total of 1 020 bp Rv2029c gene successfully amplified by PCR was inserted into the plasmid pmv261, then the fusion gene was successfully transduced into BCG. After identified by double enzyme digestion, confirmed by gene alignment and by thermally induced with Western blotting, the recombinant protein had a free primary. The recombinant live vaccine ofM.tuberculosisrBCG-Rv2029c is successfully constructed, which lay a foundation for the study of the immune mechanism of recombinant vaccine.

BCG vaccine; recombinant vaccine;Mycobacteriumtuberculosis; Rv2029c

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.016

校自科NYYZ006

滿永宏，Email: man-yh@foxmail.com

1.南陽醫學高等專科學校基礎醫學部,南陽 473061； 2.河南大學附屬南陽南石醫院，南陽 473006

Supported by the Natural Science Foundation of Nanyang Medical College (No.NYYZ006)

R378

：B

：1002-2694(2017)08-0744-04

2016-01-15編輯：梁小潔