阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠抗泡球蚴的效果

馮 祎，王 芬，劉許諾，王 昕，葉 彬

阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠抗泡球蚴的效果

馮 祎1，王 芬1，劉許諾1，王 昕2，葉 彬1

目的探索阿苯達唑亞砜(albendazole sulfoxide，ABZSO)與聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯(PLGA-PEG-PLGA)制備的阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠(ABZSO/PLGA-PEG-PLGA)抗泡球蚴的效果。方法應用ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL)、ABZSO(40 μg/mL)、PLGA-PEG-PLGA處理體外培養泡球蚴并統計原頭節的存活率，采用掃描電鏡觀察各處理組泡球蚴或原頭節形態變化；以各藥物組治療泡球蚴病大鼠動物模型后檢查泡球蚴體積大小。結果藥物處理體外培養泡球蚴18 d時，ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(40 μg/mL)原頭節存活率顯著低于ABZSO(40 μg/mL)組；掃描電鏡結果顯示ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(80 μg/mL)組的原頭節結構被顯著破壞；動物體內實驗表明ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(4 mg/mL)組對抗泡球蚴效果比其他各藥物組顯著。結論ABZSO/PLGA-PEG-PLGA具有抗泡球蚴的效果。

多房棘球絳蟲；泡球蚴病；阿苯達唑亞砜；溫敏型原位凝膠

泡球蚴病(Alveolar echinococcosis, AE)是由多房棘球蚴絳蟲幼蟲泡球蚴感染引起的一種對人體有嚴重危害的人獸共患病。如未及時治療，5年和10年的致死率分別高至70%[1]和93%[2]。目前，AE的治療主要是以根治性手術切除為主[3]，但由于泡球蚴具有侵潤性、外生性生長的特點[4]，手術并不總是有效或可行的，在某些情況下甚至可能增加傳播的風險[5]。因此，對于無法手術治療的患者而言，藥物治療便成為主要的治療途徑。在過去的20多年里，苯并咪唑類衍生物在臨床上已經廣泛用于化學治療肝泡球蚴病[6]，其中，阿苯達唑是目前國內外公認的最有效的治療藥物。然而，據相關文獻報道，阿苯達唑在體內僅作為“前體性藥物”，它的代謝產物阿苯達唑亞砜是阿苯達唑發揮作用的主要活性物質[5]，而全身給藥時，藥物在靶器官的濃度通常會很低[7]，為提高臨床治療效果,本課題組在前期成功制備了緩釋制劑-阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠(ABZSO/PLGA-PEG-PLGA)并對其藥效進行了初步的研究。本文旨在進一步考察ABZSO/PLGA-PEG-PLGA體外及動物體內抗泡球蚴的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 阿苯達唑亞砜(武漢遠成共創有限公司，純度≥98%)；PLGA-PEG-PLGA(濟南岱罡生物科技有限公司)；RPMI-1640(Sigma)。

1.1.2 采用溶劑揮發法[8]分別制備阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠(ABZSO/PLGA-PEG-PLGA)1、2、4 mg/mL及PLGA-PEG-PLGA(20%)，具體操作如下：將不同量的ABZSO及一定量的PLGA-PEG-PLGA共聚物同時溶于乙醇中，并用旋轉蒸發儀60 ℃真空干燥除去溶劑直至完全除去后再加一定量的水，最后用磁力攪拌器攪拌溶解從而配制成ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(1、2、4 mg/mL)[9]。

1.2 體外實驗

1.2.1 原頭節 泡球蚴大鼠模型，由成都醫學院基礎醫學院王昕老師贈送。在無菌條件下，從泡球蚴大鼠模型的腹腔中取出泡球蚴組織，剪碎，用含抗生素的生理鹽水沖洗3次，得到原頭節混懸液，然后用臺盼藍染液鑒別原頭節的活力，活力在95%以上即可用于體外培養。

1.2.2 藥物配制及分組 用含20%小牛血清的1640培養基分別將ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(1、2、4 mg/mL)調整濃度為20、40、80 μg/mL；將ABZSO用DMSO配制成40 μg/mL 溶液。實驗分為低劑量組(20 μg/mL)、中劑量組(40 μg/mL)、高劑量組(80 μg/mL)、ABZSO組(40 μg/mL)、PLGA-PEG-PLGA組(20%)和空白對照組(加入等量培養基)6個組。

1.2.3 方法 將收集好的原頭節混懸液振蕩均勻后，分別吸取2 mL移入12個培養瓶中，隨后給每個培養瓶加入1640培養基至20 mL，置37 ℃、5% CO2孵箱中培養。24 h后吸取200 μL原頭節混懸液用臺盼藍染色并在光鏡下計數，最后給12個培養瓶中分別加入0.2 mL上述6個組的成分(每組兩個平行培養瓶)并置于孵箱培養。實驗過程中隔天換液并計數，培養至18 d。

1.3 掃描電鏡 取上述6組藥物體外培養后的混懸液為樣本，置4%戊二醛前固定，四氧化鋨后固定，丙酮梯度脫水，切片后處理，用掃描電鏡進行觀察。

1.4 動物體內實驗

1.4.1 實驗動物及模型建立 雌性SD大鼠40只，體重(150±20)g(購自重慶醫科大學實驗動物中心)。將泡球蚴大鼠模型處死后，在無菌條件下解剖，取出泡球蚴組織并剪碎，用含抗生素的生理鹽水反復沖洗得到所需濃度的混懸液用于接種。用特制接種針于實驗大鼠右下腹穿刺腹腔接種泡球蚴組織混懸液2 mL,共接種40只，將接種好的大鼠隨機分為5組：ABZSO/PLGA-PEG-PLGA低劑量組(1 mg/mL)、ABZSO/PLGA-PEG-PLGA中劑量組(2mg/mL)、ABZSO/PLGA-PEG-PLGA高劑量組(4 mg/mL)、ABZSO組和空白對照組。

1.4.2 藥物治療方案 動物模型于感染1個月后開始使用藥物治療。根據已設定好的4個藥物組分別給模型大鼠腹腔注射藥物2 mL，每4 d給藥一次，連續治療1個月，末次給藥30 d后剖檢。

2 結 果

2.1 體外抗泡球蚴效果 各藥物組體外培養的原頭節存活率(圖1)，體外培養2 d時，空白對照組中原頭節的存活率是94%，PLGA-PEG-PLGA組的存活率是93%。體外培養18 d時，ABZSO/PLGA-PEG-PLGA (20、40、80 μg/mL) 組的原頭節存活率分別是10%,3%,1%，明顯低于對照組的原頭節存活率。

圖1 不同藥物組體外培養原頭節的存活率Fig.1 Percentage of viable protoscoleces incubated with different drug groups in vitro

2.2 掃描電鏡 通過掃描電鏡觀察實驗組和對照組中泡球蚴的形態和結構的變化如圖2。對照組中原頭節的形態正常(圖2a)，PLGA-PEG-PLGA組中原頭節的結構完整，基本無改變(圖2b), ABZSO/PLGA-PEG-PLGA (20 μg/mL)組原頭節形態有輕微的變形(圖2c)，而ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(40 μg/mL)和ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(80 μg/mL)組原頭節分別有嚴重的變形和破壞(圖2e、2f)。2.3 動物體內實驗 各治療組模型大鼠剖檢后泡球蚴的形態大小(圖3)。ABZSO組的泡球蚴體積比ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(2 mg/mL)組的大，ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(2 mg/mL)組的泡球蚴體積明顯比ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(4 mg/mL)組的大。

(a)空白對照組，(b)PLGA-PEG-PLGA組，(c)ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(20 μg/mL)組，(d)ABZSO(40 μg/mL)組，(e)ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(40 μg/mL)組，(f)ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(80 μg/mL)組圖2 經阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠處理后的泡球蚴原頭節及小囊泡的掃描電鏡觀察圖Fig.2 The ultrastructures of protoscoleces or small cysts treated with sulfoxide-loaded thermo-sensitive hydrogel under scanning electronical microscope

(a)空白對照組，(b)ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(1 mg/mL)組，(c)ABZSO(20 μg/mL)組，(d)ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(2 mg/mL)組，(e)ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(4 mg/mL)組圖3 各藥物組治療后大鼠體內泡球蚴大小圖Fig.3 Sizes of alveolar hydatid cysts in the model rats after being treated

3 討 論

泡球蚴病(AE)是一種對人體有嚴重危害的寄生蟲病,其主要侵犯肝臟，呈浸潤性生長[10]，可擴散轉移至其他器官，有惡性包蟲病[11](malignant echinococcosis)或“蟲癌”之稱，且AE患者由于早期無明顯臨床癥狀和體征而失去最佳治療機會，因而致死率極高[12]。目前，AE的治療手段有手術切除、藥物化療、手術聯合化療。由于手術切除率低，易復發，故藥物化療成為術后主要的輔助治療方式。

阿苯達唑(ABZ)作為WHO推薦的主要的抗泡球蚴病藥物[13]，主要抑制寄生蟲對葡萄糖的吸收，導致蟲體糖原耗竭，或抑制延胡索酸還原酶系統，阻礙ATP的產生，使寄生蟲無法存活和繁殖。目前，在臨床上已廣泛應用，但由于阿苯達唑為難溶性藥物，腸道吸收差，從而大大影響療效，且長期服用該藥會產生嚴重的不良反應，如頭暈、惡心、白細胞減少等[14]，為了克服上述問題，Xiao SH等[15]制得了ABZ 乳劑；Barrera MG等[16]制備ABZ微球；Palomares-Alonso F等[17]制備 了ABZ 固體分散體；Panwar P等[18]成功制備了ABZ脂質體，以上劑型雖提高了溶出度及生物利用度，但仍存在胃腸道內吸收差，體內血藥濃度低難以達到有效治療濃度、體內分布廣泛、缺乏靶向性、制備工藝復雜等缺點[19]。因此，將阿苯達唑的主要活性物質-阿苯達唑亞砜制成緩釋靶向制劑，從而能夠大大提高療效，降低毒副作用。

聚丙交酯乙交酯一聚乙二醇一聚丙交酯乙交酯(PLGA—PEG—PLGA)溫敏型水凝膠是近年來研究較多的一種緩釋制劑的藥物載體,它是以液體狀態局部注射于人體內部,在注射部位膠凝形成固態藥物儲庫的一種給藥系統，因其無毒、與親水性及疏水性藥物兼容和生物可降解等優點受到越來越多的人們的重視[20]，故以PLGA-PEG-PLGA聚合物為藥物載體，可將阿苯達唑亞砜制備成緩釋靶向制劑-阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠。

本課題組在前期研究中已成功制備了阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠，并用傅里葉紅外、核磁共振表征，體內藥動學表明阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠比阿苯達唑亞砜普通制劑釋放時間更長，且阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠對秀麗隱桿線蟲的致死率顯著高于阿苯達唑亞砜普通制劑[21]，在此基礎上，本文進一步研究阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠抗泡球蚴的效果。該研究中體外、動物體內實驗的方法參考張睿等[10]，其中，各藥物組體外抗泡球蚴結果顯示，PLGA-PEG-PLGA組中原頭節的存活率相比空白對照組無差異，ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(40 μg/mL)組原頭節存活率低于ABZSO(40 μg/mL)組，且ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(80 μg/mL)組原頭節存活率最低。與此同時，掃描電鏡觀察原頭節的結果顯示，PLGA-PEG-PLGA組中和空白對照組原頭節的結構均沒有明顯改變，ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(80 μg/mL)組原頭節的結構已嚴重破壞。

動物體內實驗中，為了避免模型動物意外死亡，泡球蚴模型大鼠在建模30 d后便開始給予各組藥物進行治療，而此時泡球蚴尚未生長至足夠大，再加上各組藥物對其生長的抑制，待90 d剖檢時各組模型大鼠體內泡球蚴均較少，故體內實驗結果只能根據所剖檢的所有泡球蚴的體積大小來初步地評價各治療組對抗泡球蚴的效果。該結果顯示，相比空白對照組，其余各治療組的泡球蚴的生長均被抑制，且ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(2 mg/mL)組的抑制作用強于ABZSO(2 mg/mL)組，而ABZSO/PLGA-PEG-PLGA(4 mg/mL)組的抑制作用最強。

綜合體內外實驗結果，可以初步判斷阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠抗泡球蚴效果優于阿苯達唑亞砜普通制劑，且其濃度越高，效果越好，為使阿苯達唑亞砜溫敏型原位凝膠能提供治療泡球蚴病的新途徑，并為臨床應用提供科學依據，仍需進一步研究。

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Ye Bin, Email:yebina@sohu.com;Wang xin,Email:joneke55@163.com

Effectofabendazolesulfoxide-loadedthermo-sensitivehydrogelonalveolarhydatidcysts

FENG Yi1, WANG Fen1, LIU Xu-Nuo1, WANG Xin2, YE Bin1

(1.DepartmentofPathogenicBiology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; (2.DepartmentofPathogenicBiology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China)

In order to explore the effect of abendazole sulfoxide-loaded thermo-sensitive hydrogel (ABZSO/PLGA-PEG-PLGA) on alveolar hydatid cysts, the viable protoscoleces incubatedinvitrowith ABZSO/PLGA-PEG-PLGA (20,40,80 μg/mL), ABZSO (40 μg/mL), PLGA-PEG-PLGA and the blank control, respectively, and the viable protoscoleces were counted. The morphological of the alveolar hydatid cysts or protoscoleces in each group were observed by scanning electron microscop(SEM). After the rats infected with alveolar hydatid cysts having been treated, the sizes of the alveolar hydatid cysts were observed. When the alveolar hydatid cysts incubated in different drug group in 18 days, the percentage of viable protoscoleces in ABZSO/PLGA-PEG-PLGA (40 μg/mL) group was lower than that of ABZSO (40 μg/mL) group. Results of SEM showed that the protoscoleces in the ABZSO/PLGA-PEG-PLGA (80 μg/mL) group were seriously damaged. Theinvivostudy demonstrated the anti-alveolar hydatid cysts efficacy of ABZSO/PLGA-PEG-PLGA (4 mg/mL) group was better than the other groups. The anti-alveolar hydatid cysts efficacy of ABZSO/PLGA-PEG-PLGA is evident.

Echinococcusmultilocularis; alveolar echinococcosis; abendazole sulfoxide; thermo-sensitive hydrogel

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.005

國家自然科學基金(No. 30972567, 81672045)資助

葉 彬,Email:yebina@sohu.com 王 昕，Email:joneke55@163.com

1.重慶醫科大學病原生物學教研室，重慶醫科大學分子生物學與腫瘤研究中心，重慶 400016； 2.成都醫學院病原生物學教研室，成都 610083

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.30972567, 81672045)

R383.3

：A

：1002-2694(2017)08-0690-04

2017-02-28編輯：梁小潔