豬鏈球菌2型轉錄調控因子Rex原核表達及體外結合活性分析

王 勇，祝昊丹，何孔旺，范紅結

豬鏈球菌2型轉錄調控因子Rex原核表達及體外結合活性分析

王 勇1,2,3，祝昊丹1,3，何孔旺1,3，范紅結2

目的克隆豬鏈球菌2型轉錄調控因子Rex的編碼基因進行原核表達和純化，對其進行生物信息學分析和體外結合活性測定。方法PCR擴增豬鏈球菌2型強毒株SS2-1的Rex基因編碼區，將其克隆入pET28a質粒中，再將pET28a-Rex重組質粒轉入大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，重組菌株經IPTG誘導后能表達出豬鏈球菌Rex蛋白；通過體外凝膠遷移實驗( EMSA)對Rex蛋白與DNA的結合活性進行分析。結果成功地原核表達并純化了Rex重組蛋白。Rex蛋白與自身啟動子Prex特異性結合，高濃度的NADH抑制兩者的結合活性，而NAD+對結合沒有影響。結論通過體外結合試驗發現Rex 是通過響應NADH/NAD+平衡來調控自身基因的表達。

豬鏈球菌；Rex；調控因子

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是一種重要的人獸共患病原菌，可導致腦膜炎，關節炎，敗血癥等疾病。該病原菌造成仔豬大量死亡，給全球養豬業造成巨大的經濟損失[1]。通過莢膜分型，有35個血清型，其中2型在患病豬和患病人群中分離率是最高的[2-3]。在亞洲地區，豬鏈球菌病是一種重要的公共衛生疾病，主要引起成人腦膜炎[4]。1998年和2005年在我國江蘇和四川暴發了由豬鏈球菌2型引起的豬鏈球菌感染疫情，給公共衛生安全造成了極大的危害，受到國內外廣泛關注[2,5]。

細菌在感染過程中，需要感知復雜多變的宿主體內環境，調節各種相關基因的表達，以達到在宿主體內生存、繁殖和致病的目的。轉錄調節因子是有機體應對動態環境的一個重要機制。Rex是一種廣譜轉錄調節因子，在細菌的生存過程中起重要作用。首先在天藍色鏈霉菌中發現轉錄調節因子Rex響應胞內NADH/NAD+平衡[6]。之后在糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、金黃色葡球菌(Staphylococcusaureus)、變形鏈球菌(Streptococcusmutans)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等的轉錄調控均有大量報道。豬鏈球菌中Rex的功能尚不清楚。

本研究對SS2強毒株SS2-1的轉錄調控因子Rex進行生物信息學分析，利用大腸桿菌原核表達系統對Rex蛋白進行體外表達和純化，研究Rex蛋白與體外靶基因的結合活性,為后續深入研究Rex的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和引物 所用的菌株、質粒及引物分別見表1和表2，引物由上海英濰捷基公司合成。

表1 菌株及質粒Tab.1 Bacterial strains and plasmids used in this study

表2 PCR擴增引物Tab.2 Primers used in this study

1. 2 主要試劑 PCR Mix和DNA Marker購于Vazyme公司，pMD19-T載體和DNA限制性內切酶購于TaKaRa公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購于Axygen；THB和LB培養基購于美國BD公司；NAD+和NADH購于 Sigma公司；EMSA/Gel-shift結合緩沖液和上樣緩沖液購于碧云天生物公司。

1.3Rex基因克隆和生物信息學分析 以SS2-1基因為模板，設計引物Rex-F/Rex-R，利用Prime STAR HS DNA聚合酶進行PCR擴增。PCR擴增程序為：94 ℃ 2 min，98 ℃ 15 s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1 min，30 個循環，72 ℃ 5 min。電泳檢測。回收目的片段。將目的片段回收產物與pMD19-T載體進行連接，轉化到感受態細胞DH5α，挑取陽性克隆測序。使用EditSeq翻譯成氨基酸序列，用Blastp和ClustalW等生物信息學工具對Rex氨基酸序列進行分析，并用ESPript 3.0 對ClustalW對比結果進行二級結構分析。

1.4 表達質粒的構建與鑒定 將含有 pET28a質粒的宿主菌DH5α單菌落接種至LB液體(含卡那霉素50 μg/mL)中，37 ℃過夜培養。按質粒提取試劑盒說明書抽提質粒DNA，以BamH I、XhoI進行雙酶切，電泳回收線性化的質粒DNA。將質粒雙酶切回收產物與雙酶切的PCR產物進行連接，轉化到感受態細胞DH5α，經PCR和雙酶切鑒定后，將重組表達質粒pET28a-Rex轉化進表達宿主BL21(DE3)，挑取陽性克隆測序。

1.5 重組蛋白質的誘導表達與純化 將含重組質粒pET28a-REX的大腸桿菌BL21 (DE3) 接種LB液體，37 ℃搖振培養3～4 h，至 OD600值為0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，繼續劇烈搖振培養3～4 h。離心去上清，于沉淀中加 SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后煮沸10 min，進行SDS-PAGE。將重組菌擴大培養并經 IPTG 誘導表達，離心收集菌體，PBS 重懸后冰浴超聲破碎菌體，離心后的上清過濾，用GE Healthcare公司的His-Tag親和層析柱純化重組蛋白質。

1.6 凝膠阻滯分析(Electrophoresis mobility shift assay，EMSA) Rex與啟動子DNA體外結合活性。

1.6.1 Rex與啟動子DNA體外結合 EMSA實驗：PCR擴增Rex基因啟動子區并對產物純化回收。反應體系(10 μL)：蛋白 1 μL，DNA 1 μL，5×Binding buffer 2 μL，H2O26 μL；30 ℃水浴20 min。在反應樣品中1 μL 10×Loading buffer，將樣品加至6%變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。將電泳完畢取下的凝膠放入0.5 μg/mL EB溶液中染色15 min后置于凝膠成像系統中觀察。

1.6.2 NADH和NAD+對Rex與特異性DNA片段結合活性的影響 按方法1.6.1研究NADH和NAD+對Rex與特異性DNA片段結合活性的影響，結合反應進行20 min后，在結合反應樣品中分別添加不同濃度(0、5、10和50 mmol/L)的NADH和NAD+繼續反應15 min，染色觀察。

2 結 果

2.1Rex生物信息學分析 SS2-1的Rex蛋白的開放閱讀框ORF由639個核苷酸組成，編碼213個氨基酸，預測分子量為24 kDa。通過blastp 比對后，結果發現SS2-1 Rex蛋白與金黃色葡球菌、糞腸球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、變形鏈球菌和肺炎鏈球菌中的Rex家族蛋白的氨基酸序列分別具有44.7%、51.0%、71.9%、72.4%、73.8%、76.7%和78.7%的一致性。 以無乳鏈球菌的Rex蛋白晶體結構Protein data bank(PDB)為模型，使用ClustalW軟件和ESPript 3.0對其同源蛋白進行多重序列比對和二級結構分析。N-端是特異的DNA結合位點，以及1個可結合DNA靶序列的螺旋-轉角-螺旋(Helix-turn-helix)基序，而該部分序列在Rex蛋白家族成員中非常保守(圖1)。結合NAD(H)的C-端有一個Rossmann折疊，這個折疊由典型的2個β-α-β-α-β結構單元系列組成,通過α-螺旋，它們一同形成了一個平行的β-折疊，這是在依賴NAD(H)脫氫酶(如乳酸脫氫酶)中的典型結構特征。

2.2 重組表達質粒鑒定Rex基因PCR擴增后，經雙酶切、純化，定向克隆到表達載體 pET28a中，轉化到大腸桿菌 DH5α。挑取陽性克隆提取質粒，圖2為重組表達質粒經BamH I和XhoⅠ雙酶切鑒定結果，這表明目的片段已成功插入到表達質粒中。

1: BamH I/Xho I double restriction enzymes

2.3 SDS-PAGE分析和Western blotting鑒定 SDS-PAGE分析結果表明，含重組表達質粒pET28a-Rex的E.coliBL21經IPTG誘導后在27 kDa左右處有1條明顯的蛋白條帶，分子量大小與預期一致(圖3-A)。利用His親和層析柱對表達產物進行純化，將純化蛋白用12% SDS-PAGE方法進行蛋白電泳，轉印后，以His-Tag單克隆抗體為一抗進行Western blotting鑒定分析(圖3-B)。

A: SDS-PAGE analysis of the purification.1:Non-induced pET28a/BL21, 2:Induced pET28a/BL21,3:Non-induced pET28a-Rex/BL21,4:Induced pET28a-Rex/BL21,5:Induced pET28a-Rex/BL21 Insoluble fraction, 6:Induced pET28a-Rex/BL21 Soluble fraction. B:Western blot with monoclonal antibody against His-tag. 1: rSsRex圖3 SDS-PAGE 分析和Western blotting鑒定Fig.3 Recombinant protein by SDS-PAGE and Western blotting

圖1 Rex同源蛋白的多重序列比對和結構分析Fig.1 Structure-based multiple sequence alignment of Rex ortholog protein

2.4 凝膠阻滯分析(Electrophoresis mobility shift assay，EMSA) Rex與啟動子DNA體外結合活性

2.4.1 Rex與啟動子DNA體外結合 EMSA實驗結果證實Rex蛋白能與其自身啟動子序列(Prex)特異性的結合，而非特異性DNA與Rex蛋白不發生作用(圖4 )。 隨著Rex蛋白濃度的增加 (從0 ng遞增到500ng)，結合的DNA越多，游離的DNA片段越少(圖5 )，初步說明Rex蛋白能調控自身的轉錄，且隨著Rex蛋白增多，結合的Prex也越多。

1:Prex; 2,3,4,5,6,7:ive pieces of unspecific DNA; and Rex protein，respectively圖4 胞外Rex蛋白與特異性DNA的結合Fig.4 In vitro binding of protein Rex with specific DNA oligo

圖5 胞外Rex蛋白與Prex的結合活性Fig.5 In vitro binding activity between protein Rex and Prex

2.4.2 NADH和NAD+對Rex與特異性DNA片段結合活性的影響 競爭試驗結果表明NADH抑制Rex蛋白與自身啟動子序列Prex的結合，且隨著濃度的增加抑制效果越強(圖6-A)；NAD+則不影響兩者的結合(圖6-B),與在變形鏈球菌中報道的研究結果相一致[8]。

圖6 NADH和NAD+對Rex與特異性DNA片段結合活性的影響Fig.6 The effect of NADH and NAD+ on specific DNA oligo binding activity of Rex

3 討 論

細菌通過監測代謝產物或特定化合物在細胞內氧化還原狀態產生相應的信號，通過誘導調節蛋白或酶的構象變化等方式最終作出生物反應[11]。在天藍色鏈霉菌和枯草芽孢桿菌的研究中，發現了一種稱為Rex的新型轉錄調節因子，能直接響應胞內NADH/NAD+平衡變化。在枯草芽孢桿菌中，當有氧呼吸過程中缺氧時，NADH濃度增加，Rex抑制的基因轉錄被激活，這使具有更高氧氣親和力細胞色素bd和乳酸脫氫酶的形成增加，以保證氧的有效利用和多余的NADH的循環利用。在金黃色葡萄球菌，Rex調節厭氧發酵和NAD+再生途徑。在變形鏈球菌中Rex對生物被膜形成和氧化應激起重要作用。

通過對強毒株SS2-1基因組中編碼Rex蛋白的氨基酸序列進行序列比對分析，發現豬鏈球菌Rex蛋白與金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、變形鏈球菌和肺炎鏈球菌中的Rex家族蛋白的氨基酸序列高度一致；結構域分析發現Rex家族蛋白的N端都具有DNA結合蛋白中常見的螺旋-轉角-螺旋(Helix-turn-helix)基序，且非常保守(圖1)，保證了Rex蛋白能夠結合特異性DNA序列從而調控靶基因的表達，提示豬鏈球菌Rex作為Rex調控蛋白家族成員的一員，具有其共同的結構特征和類似的調控機制。

利用大腸桿菌原核表達系統成功表達并純化了強毒株SS2-1的Rex蛋白。體外EMSA實驗證實了Rex蛋白對自身啟動子序列Prex具有直接的結合活性，說明在豬鏈球菌中Rex蛋白可直接作用于自身基因啟動子區從而直接調控自身的轉錄。此外，EMSA實驗還表明NADH和NAD+都能結合Rex蛋白，但只有NADH能使Rex失去對Prex的親和力，而 NAD+對結合沒有影響，即NADH和NAD+競爭結合Rex，提示在豬鏈球菌中Rex發揮著氧化還原調控作用。該結果為我們進一步研究Rex的功能奠定了基礎。

[1] Goyette DG, Auger JP, Xu J, et al.Streptococcussuis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing [J]. Emerg Microbes Infect, 2014, 3(6): e45. DOI: 10.1038/emi.2014.45

[2] Feng Y, Zhang H, Wu Z, et al.Streptococcussuisinfection: an emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases [J]. Virulence, 2014,5(4):477-497. DOI: 10.4161/viru.28595

[3] Liu HZ, Yuan XM. Research advances in clinical laboratory diagnosis ofStreptococcussuisinfection[J]. Chin J Zoonoses,2016,32(5):490-493. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.001

劉海珠,袁曉明.人豬鏈球菌感染的臨床實驗室診斷研究進展[J].中國人獸共患病學報, 2016,32(5):490-493.

[4] Gong G, Yi XCM, Luo RB，et al. Isolation and identification of strain SS and antibiotic resistance in Tibet pig[J]. Chin J Zoonoses, 2016,32(11):987-990. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.011.008(in Chinese)

貢嘎,以西措姆,羅潤波.藏豬鏈球菌的分離鑒定及耐藥性研究[J].中國人獸共患病學報, 2016,32(11):987-990.

[5] Tang J, Wang C, Feng Y, et al. Streptococcal toxic shock syndrome caused byStreptococcussuisserotype 2 [J]. PLoS Med, 2006, 3: e151. DOI: 10. 1371/journal. pemed. 0030151

[6] Brekasis D, Paget M S. A novel sensor of NADH/NAD+redox poise inStreptomycescoelicolorA3(2) [J]. EMBO J, 2003,22(18):4856-4865. DOI: 10.1093/emboj/cdg453

[7] Wang E, Bauer MC, Rogstam A, et al. Structure and functional properties of theBacillussubtilistranscriptional repressor Rex[J]. Mol Microbiol,2008, 69:466-478. DOI:10.1111/j.1365-2958.2008.06295.x

ProkaryoticexpressionofRextranscriptionregulatorinStreptococcussuis2andinvitrobindingassay

WANG yong1,2,3，ZHU Hao-dan1,3，HE Kong-wang1,3,FAN Hong-jie2

(1.InstituteofVeterinaryResearch,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofEngineeringResearchofVeterinaryBio-products,MinistryofAgriculture,Nanjing210014,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China; 3.KeyLabofFoodQualityandSafetyofJiangsuProvince-StateKeyLaboratoryBreedingBase,Nanjing210014,China)

We cloned and prokaryoticly expressed the gene encoding Redox regulator(Rex)ofStreptococcussuisserotype 2 and analyzed biological information andinvitrobinding activity. The encodingRexgene of SS2-1 strain was amplified by PCR with the designed primers, and then cloned into prokaryotic expression plasmid pET28a. The recombinant plasmid pET28a-Rex was transformed intoE.coliBL21. After induced expression by IPTG, the Rex protein was obtained. The binding activity of Rex protein and DNA was analyzed by gel mobility shift assay (EMSA)invitro. Purification of recombinant protein Rex was successfully expressed. The presence of NAD+did not have major effect on mobility shift, but addition of NADH almost abolished such a binding activity. Byinvitrobinding assay, Rex was found to regulate the expression of Prex in response to NADH/NAD+equilibrium.

Streptococcussuis; Rex; transcriptional regulator

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.003

國家轉基因生物新品種培育重大專項子課題(No.2014ZX0800946B-002)；國家公益性行業科研專項(No.201303041)

何孔旺，Email：kwh2003@263.net

1.江蘇省農業科學院獸醫研究所·農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，南京 210014； 2.南京農業大學動物醫學院，南京 210095； 3.江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，南京 210014

Supported by the National Genetically Modified Organisms Breeding Major Projects of China(No.2014ZX0800946B-002)and the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest(No.201303041) Corresponding author: He Kong-wang, Email: kwh2003@263.net

R373.1

：A

：1002-2694(2017)08-0680-05

2016-11-25編輯：張智芳